בידוד של תאי גזע סרטני מדגימות אדם סרטן הערמונית
Summary
הבידוד של תאי גזע סרטני (CSCs) ישירות מרקמות אנושיות הוא הנדרש לאפיון הביולוגי שלהם. כתב יד זה מתאר מתודולוגיה לבידודה של CSCs ערמונית מרקמות אנושיות, תוך מתן טיפים על פתרון בעיות בצעדים קשים גם.
Abstract
מודל תאי גזע סרטני (CSC) כבר בקר במידה ניכרת במהלך שני העשורים האחרונים. במהלך תקופה זו CSCs זוהה ובודד ישירות מרקמות אנושיות ומופץ באופן סדרתי בעכברים עם מערכת חיסון חלש, בדרך כלל באמצעות תיוג נוגדן של אוכלוסיות של תאים וחלוקה על ידי cytometry זרימה. עם זאת, המאפיינים הקליניים הייחודיים של סרטן הערמונית באופן משמעותי מוגבלים על המחקר של CSCs ערמונית מדגימות גידול אנושיים טריות. לאחרונה דיווחו על הבידוד של CSCs ערמונית ישירות מרקמות אנושיות מכוח פנוטיפ (HLAI) שלילי כיתת HLA שלהם. תאי סרטן ערמונית נקצרים מן הדגימות כירורגית וניתקו באופן מכאני. השעיה תא שנוצרה ושכותרתו עם נוגדני HLAI וסטרומה מצומדות fluorescently. תת אוכלוסיות של תאי HLAI השליליים סוף סוף מבודדות באמצעות cytometer זרימה. המגבלה העיקרית של פרוטוקול זה היא הטבע בתדירות גבוהה המיקרוסקופי והמולטי שלסרטן ראשוני בדגימות ערמונית. יחד עם זאת, CSCs ערמונית חי המבודד מתאים לאפיון מולקולרי ואימות פונקציונלית על ידי השתלה בעכברים עם מערכת חיסון חלש.
Introduction
ההטרוגניות intratumoral נחשבת לסימן היכר של סרטן 1. ואכן, מספר מנגנונים של הטרוגניות intratumoral תוארו, כולל מוטציה ואינטראקציות עם microenvironment גנטיים. בנוסף, סוגים מסוימים של סרטן עשויים להכיל היררכיה סלולרית עם subpopulation של תאי גזע סרטני (CSCs) המציג את המאפיינים של יכולת ייזום גידול והתחדשות עצמית במבחני השתלה סידוריים 2-5. תאר בתחילה בהמטולוגיות 6, 7 שד, ומוח 8 ממאירות, CSCs נחקר גם בסרטן ערמונית 9-12, כמו גם סוגי גידולים אחרים 2-5.
CSCs נחשב בדרך כלל חלק קטן הסלולר בתוך אוכלוסייה הטרוגנית 2-5. לכן, האפיון הפונקציונלי ומולקולרי של CSCs מותנה ההעשרה שלהם מאוכלוסיות בתפזורת. בהתאם לכך, בשני העשורים האחרונים כמה נפגשוhodologies העשרת CSC כבר המציא אשר בדרך כלל כרוך בהפרדה בין אוכלוסיות שכותרתו על ידי cytometry זרימה. בנוסף, שיקול משמעותי במחקר של CSCs הוא שהארגון ההיררכי של רקמות אנושיות עשוי להיות מופר על ידי מניפולציות ניסוייות כגון passaging הסידורי בעכברים עם מערכת חיסון חלש או תרבות. כתוצאה מכך, הבידוד הישיר של CSCs מרקמות אנושיות התפתחה המתודולוגיה חשובה בתחום CSC.
סרטן הערמונית הוא סיבה מובילה לתחלואה בסרטן והתמותה בארצות הברית וברחבי העולם 13. לכן, הבידוד והאפיון ביולוגי של CSCs הערמונית הוא עניין משמעותי. CSCs ערמונית בעבר כבר מועשר משורות תאים, xenografts מטופל נגזר, ותרבויות השעיה מטופל נובע מעבר נמוך 9,10,12,14.
לאחרונה דיווחו על הבידוד של CSCs ערמונית ישירות מים כירורגית אדםamples מכוח פנוטיפ תא שטח HLAI השלילי 10. כאן אנו מפרטים את הנהלים המיושמים לבידוד של תאים אלה. גידולי ערמונית נקצרים מן הדגימות כירורגית וגרמו להשעיות תא. לאחר מכן תאים הם מוכתמים באמצעות נוגדנים נגד HLAI כמו גם סמני סטרומה וכדאיויות, וCSCs מבודדים על ידי מיון תא הקרינה מופעלת (FACS). CSCs הבודד לאחר מכן ניתן להשתמש עבור מבחני הדורשים תאי קיימא.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרוטוקול זה מתאר את בידודו של CSCs מרקמות סרטן ערמונית אנושית טריות. כמה שיקולים חשובים להשפיע על התוצאות המוצלחות של פרוטוקול זה.
ההתאוששות של מספרים גבוהים של תאי סרטן ערמונית קיימא תלויה בהערכה זהירה ברוטו של דגימות כירורגית. מ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרן משפחת חרירי וקרן TJ מארטל.
Materials
| RPMI | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Fetal bovine serum | Gibco Life Technologies | 10437-028 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| PBS | Corning cell gro | 21-031-CM | |
| 60 mm-15 mm cell culture dish | Corning | 3295 | |
| 35 µm Cell Strainer | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml conial tube | Crystalgen | 23-2263 | |
| 15 ml conical tune | Crystalgen | 23-2265 | |
| Red blood cell lysing buffer | Sigma | R7757 | |
| HLA class I (W6/32) PE antibody | Abcam | ab43545 | |
| CD31 FITC antibody | ebioscience | 11-0319-42 | |
| CD45 FITC antibody | Abcam | ab27287 | |
| IgG2aκ PE antibody | BD Pharminogen | 555574 | |
| IgG1κ FITC antibody | BD Pharminogen | 551954 | |
| DAPI | Invitrogen | d3571 | |
| 12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap | BD Falcon | 352235 | |
| Vortex Mixer | Crystalgen | CG-BV1000 | |
| 10% Neutral Buffer Formalin | Fisher | RBBP-0480 |
Referências
- Hanahan, D., Weinberg, R. A. Hallmarks of cancer: the next generation. Cell. 144, 646-674 (2011).
- Magee, J. A., Piskounova, E., Morrison, S. J. Cancer stem cells: impact, heterogeneity, and uncertainty. Cancer Cell. 21, 283-296 (2012).
- Nguyen, L. V., Vanner, R., Dirks, P., Eaves, C. J. Cancer stem cells: an evolving concept. Nat. Rev. Cancer. 12, 133-143 (2012).
- Valent, P., et al. Cancer stem cell definitions and terminology: the devil is in the details. Nat. Rev. Cancer. 12, 767-775 (2012).
- Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell Stem Cell. 10, 717-728 (2012).
- Lapidot, T., et al. A cell initiating human acute myeloid leukaemia after transplantation into SCID mice. Nature. 367, 645-648 (1994).
- Al-Hajj, M., Wicha, M. S., Benito-Hernandez, A., Morrison, S. J., Clarke, M. F. Prospective identification of tumorigenic breast cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100, 3983-3988 (2003).
- Singh, S. K., et al. Identification of human brain tumour initiating cells. Nature. 432, 396-401 (2004).
- Collins, A. T., Berry, P. A., Hyde, C., Stower, M. J., Maitland, N. J. Prospective identification of tumorigenic prostate cancer stem cells. Cancer Res. 65, 10946-10951 (2005).
- Domingo-Domenech, J., et al. Suppression of acquired docetaxel resistance in prostate cancer through depletion of notch- and hedgehog-dependent tumor-initiating cells. Cancer Cell. 22, 373-388 (2012).
- Patrawala, L., Calhoun-Davis, T., Schneider-Broussard, R., Tang, D. G. Hierarchical organization of prostate cancer cells in xenograft tumors: the CD44+alpha2beta1+ cell population is enriched in tumor-initiating cells. Cancer Res. 67, 6796-6805 (2007).
- Qin, J., et al. The PSA(-/lo) prostate cancer cell population harbors self-renewing long-term tumor-propagating cells that resist castration. Cell Stem Cell. 10, 556-569 (2012).
- Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. Cancer statistics, 2013. CA Cancer J. Clin. 63, 11-30 (2013).
- Patrawala, L., et al. Highly purified CD44+ prostate cancer cells from xenograft human tumors are enriched in tumorigenic and metastatic progenitor cells. Oncogene. 25, 1696-1708 (2006).
