Isolering af kræft stamceller fra humane Prostata Cancer Prøver

Summary

Isoleringen af ​​kræft stamceller (CSCS) direkte fra humane væv er nødvendige for deres biologiske karakterisering. Dette håndskrift beskriver en metode til isolering af prostata CSCs fra humane væv, og samtidig give tips om fejlfinding vanskelige skridt.

Abstract

Den kræft stamceller (CSC) model er blevet betydeligt revisited løbet af de sidste to årtier. I løbet af denne tid er blevet identificeret CSCs og direkte isoleret fra humane væv og serielt opformeret i immunsvækkede mus, typisk gennem antistof mærkning af subpopulationer af celler og fraktionering ved flowcytometri. Imidlertid har de unikke kliniske træk ved prostatakræft betydeligt begrænset undersøgelse af prostata CSCs fra friske humane tumorprøver. Vi har for nylig rapporteret isolering af prostata CSCs direkte fra humane væv i kraft af deres HLA klasse I (HLAI)-negative fænotype. Prostata cancer celler høstes fra kirurgiske prøver og mekanisk dissocieret. En celle suspension genereres og mærket med fluorescens konjugerede HLAI og stromale antistoffer. Subpopulationer af HLAI-negative celler er endelig isoleres under anvendelse af et flowcytometer. Den grundlæggende begrænsning af denne protokol er den ofte mikroskopiske og multifokal karakterprimær kræft i prostatektomi prøver. Ikke desto mindre, isolerede levende prostata CSCs er velegnede til molekylær karakterisering og funktionel validering af transplantation i immunsvækkede mus.

Introduction

Intratumoral heterogenitet anses for at være kendetegnende for kræft ^1. Faktisk har flere mekanismer intratumoral heterogenitet er blevet beskrevet, herunder genetisk mutation og interaktioner med mikromiljø. Desuden kan nogle kræftformer indeholde et cellulært hierarki med en delpopulation af cancer stamceller (CSCS), der udviser egenskaberne for tumor-initierende kapacitet og selv-fornyelse i serietransplantation assays ^2-5. I første omgang er beskrevet i hæmatologiske ^6, bryst ⁷ og hjerne ⁸ maligne lidelser, er CSCs også blevet undersøgt i prostatakræft ^9-12 samt andre tumortyper ^2-5.

CSCs er generelt betragtes som en cellulær fraktion i en heterogen population ^2-5. Derfor er det funktionelle og molekylær karakterisering af CSCs er betinget af deres berigelse fra bulk befolkninger. Følgelig løbet af de sidste to årtier adskillige opfyldthodologies CSC berigelse er blevet udtænkt som typisk indebærer adskillelse af mærkede befolkninger ved flowcytometri. Derudover er en væsentlig overvejelse i studiet af CSCs er, at den hierarkiske organisering af humane væv kan forstyrres af eksperimentelle manipulationer såsom seriepassage i kultur eller immunsvækkede mus. Som følge heraf er den direkte isolering af CSCs fra humane væv opstået som en vigtig metode i CSC feltet.

Prostatakræft er en førende årsag til kræft sygelighed og dødelighed i USA og rundt om i verden ^13.. Derfor er isolationen og biologisk karakterisering af prostata CSCs er af væsentlig interesse. Prostata CSCs er tidligere blevet beriget fra cellelinjer, patient afledte xenotransplantater og lavpassage patient afledt suspensionskulturer ^9,10,12,14.

Vi har for nylig rapporteret isolering af prostata CSCs direkte fra humane kirurgiske ssempler i kraft af deres HLAI-negative celle overflade fænotype ^10. Her har vi detaljeret de procedurer, til isolering af disse celler. Prostatatumorer høstes fra kirurgiske prøver og gjort til cellesuspensioner. Cellerne farves derefter ved hjælp af antistoffer mod HLAI samt stromale og levedygtighed markører, og CSCs isoleres ved fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS). Isolerede CSCs kan derefter anvendes til assays, der kræver levende celler.

Protocol

1.. Høst og behandling af menneskelige prostatakræft Tissue fra kirurgisk prøvemateriale Forbered to 50 ml polystyren koniske rør indeholdende 15 ml af Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 dyrkningsmedium suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin. Patologi servicepersonale høste primære og metastatisk prostatacancer prøver fra prostatektomi og palliativ kirurgi prøver, henholdsvis under en Institutional Review Board godkendte protokol. Kan fås metas…

Representative Results

Figur 1. Human prostatakræft tumor høst og flowcytometri plot illustrerer specifikke populationer fra en human prostatacancer. (A) Tumor knuder høstes for at generere en cellesuspension. Tumor indhold af den forarbejdede prøve bekræftes ved hjælp af konventionelle hematoxylin og eosin-farvning. (B)…

Discussion

Denne protokol beskriver isoleringen af ​​CSCs fra friske humane prostata cancer væv. Flere vigtige overvejelser påvirke det vellykkede resultat af denne protokol.

Genopretningen af ​​høje antal af levedygtige prostatacancerceller er afhængig af omhyggelig brutto vurdering af kirurgiske prøver. Det er vores erfaring, er den vellykkede isolering af tumorigene prostata celler bedst sikret, når makroskopiske tumorknuder observeres og behandles ^10.

<p class="jove_con…

Materials

RPMI	Gibco Life Technologies	11875-093
Fetal bovine serum	Gibco Life Technologies	10437-028
Penicillin Streptomycin	Gibco Life Technologies	15140-122
PBS	Corning cell gro	21-031-CM
60 mm-15 mm cell culture dish	Corning	3295
35 µm Cell Strainer	BD Falcon	352340
50 ml conial tube	Crystalgen	23-2263
15 ml conical tune	Crystalgen	23-2265
Red blood cell lysing buffer	Sigma	R7757
HLA class I (W6/32) PE antibody	Abcam	ab43545
CD31 FITC antibody	ebioscience	11-0319-42
CD45 FITC antibody	Abcam	ab27287
IgG2aκ PE antibody	BD Pharminogen	555574
IgG1κ FITC antibody	BD Pharminogen	551954
DAPI	Invitrogen	d3571
12 x 75 mm polystyrene tubes with cell strainer cap	BD Falcon	352235
Vortex Mixer	Crystalgen	CG-BV1000
10% Neutral Buffer Formalin	Fisher	RBBP-0480