Harmonic Nanopartikel für Regenerative Forschung
Summary
Protokolldaten werden für in vitro-Markierung humaner embryonaler Stammzellen, die mit der zweiten Harmonischen erzeugenden Nanopartikeln bereitgestellt. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster werden ebenfalls vorgestellt.
Abstract
In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit zweiten Harmonischen Nanopartikel (HNPs) vorgesehen ist. Letztere sind eine neue Gruppe von Sonden kürzlich zur Markierung von biologischen Proben für Mehrphotonenabbildungs eingeführt. HNPs der Lage sind, eine Verdoppelung der Frequenz der Anregungslicht durch die nichtlinearen optischen Prozeß der Erzeugung der zweiten Harmonischen, ohne Beschränkung auf die Anregungswellenlänge.
Multi-Photonen-basierte Methoden für die hESC Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden im Detail vorgestellt. Insbesondere ist Beweis, wie die intensive zweiten Harmonischen (SH) Emission von isolierten HNPs während der 3D-Überwachung von Herzgewebe zu schlagen in 3D gezeigt maximieren. Die Analyse der entstandenen Bilder, 3D-Verschiebungsmuster abzurufen ist auch beschrieben.
Introduction
Lineare Mikroskopiesysteme, die dank ihrer inhärenten dreidimensionalen Schneidefunktionen ausgelöst zunehmend die Nachfrage nach fotostabilen Fluorophore mit Zwei-Photonen-Absorptionsbanden im nahen Infrarot. Nur in den letzten paar Jahren, um die Entwicklung der Fluoreszenz-basierten Etiketten (Farbstoffe, Quantenpunkte Up-Converting-Nanopartikel), eine unterschiedliche bildgebende Methode ist die Verwendung einer neuen Familie von Natur aus nicht-linearen Nanopartikel als Etiketten zu nutzen, dh ergänzen Harmonische Nanopartikel (HNPs), die speziell für Multiphotonenmikroskopie entwickelt wurden. Diese Etiketten, basierend auf nicht-zentrosymmetrischen anorganischen Kristallen, ausüben optischen Kontrast Erzeugen des SH der Anregungsfrequenz: z. B. durch Umsetzen einer Fraktion von Nahinfrarot-Pulsanregungslicht (λ = 800 nm) in sichtbares blaues Licht (λ / 2 = 400 nm) . Mehrere Autoren in der jüngsten Vergangenheit haben verschiedene Materialien getestet, darunter Eisen Fe Jodat (IO <sub> 3) 3 1, Kaliumniobat (KNbO 3) 2, Lithiumniobat (LiNbO 3) 3, Barium-Titanat (BaTiO 3) 4,5-, Kalium-Titanyl-Phosphat (KTiOPO &sub4;, KTP) 6-8, und Zinkoxid (ZnO ) 5,9,10. Verglichen mit Fluoreszenzsonden, HNPs besitzen eine Reihe von attraktiven Eigenschaften, wie vollständiger Abwesenheit von Bleichen und blinkt, schmalen Emissionsbanden, Anregungswellenlängen-Abstimmbarkeit (von Ultraviolett bis Infrarot), Orientierung Gewinnungsfähigkeit und kohärente optische Antwort. Diese einzigartigen Eigenschaften wurden kürzlich in zwei umfassende Überprüfung Papiere 11,12 erklärt. Die Möglichkeit der Arbeit in den infraroten Spektralbereich, die Bildtiefe erhöht sich durch die Minimierung Streuung und Absorption, drastisch begrenzt Beispielfoto Abbau 13,14. Darüber hinaus ist die unendlich Foto-stabiles Signal von HNPs garantiert macht sie zu idealen Sonden für die langfristige Zellverfolgung, die ichist besonders attraktiv für die regenerative Medizin-Anwendungen 15.
In diesem Experiment sichtbar gemacht werden Protokolldetails für in-vitro-Markierung von humanen embryonalen Stammzellen (hES) mit nicht funktionalisierten HNPs Verfügung gestellt. Die Synthese und Herstellung von kolloidalen Suspensionen in einer früheren Veröffentlichung und die darin aufgeführten 16 und geht über den Umfang dieser Arbeit. Methoden zur Untersuchung von hESC Multi-Photonen-Mikroskopie und deren Differenzierung in Herz Cluster (als langfristige Klimaflüssigkulturen gepflegt) werden vorgestellt. Menschliche ESC lassen kann innerhalb sog. Embryoid Bodies (EBs) auf zwei verschiedenen Wegen, entweder durch EB Bildung von Kolonie-Fragmente in Suspension oder alternativ Zwangs Aggregation von einzelnen Zellen in EBs mit der Aggrewell Platte, wie in 1A dargestellt zu unterscheiden . Kultivierung schlagen Cluster von Herzzellen von Polytetrafluorethylen (PTFE), poröse Filter facilitates ihre langfristige Wartung für weitere Untersuchungen (z. B. elektrophysiologischen Messungen von Aktionspotentialen).
Die Anregungsquelle des Rastermikroskops ist in der Lage, ultrakurze Pulse (mit einer Pulsdauer kleiner als 300 fs bei der Probe), um die Spitzenleistung benötigt, um zweite harmonische Bildgebung HNPs zuführen erreichen liefern. Zum Beispiel, die häufigste Quelle für fs-Bildgebung verwendet werden abstimmbaren Ti: Saphir-Laser. Alternativ können andere Ultrakurzpulslaser eingesetzt werden, beispielsweise mit Erbium-Ionen-17 Chrom Forsterit 18 oder Ti: Saphir-gepumpten optischen parametrischen Oszillatoren Infrarot. Das Mikroskop mit einem Objektiv mit vorzugsweise einem relativ hohen numerischen Apertur ausgestattet werden. Sehr wichtig ist, vor der Messung, und jedes Mal, wenn die Ziel ersetzt wird, ist es zwingend notwendig, in den Aufbau (Linsen), die die vorliegende Dispersion durch Optimieren der Einstellungen des Laserimpulses Vorverdichter an der Arbeits minimierenWellenlänge der Wahl. Dieses Verfahren, das in dem Protokoll beschrieben, stellt sicher, dass der Laserimpuls ist so nah wie möglich an der zu transformieren begrenzter Dauer (dh kürzesten wie möglich) in der Brennebene und maximiert die Probe nichtlinearen Antwort.
Das Ziel des am Ende des Protokolls beschriebenen Bildanalyse ist die Identifizierung und Verfolgung in 3D HNPs Bewegungen mit den rhythmischen Kontraktionen des Herz schlagen Cluster verbunden. Tracking-Nanopartikel in der Bildebene wird einfach durch Ermittlung ihrer Positionen in aufeinanderfolgenden Filmrahmen realisiert. Informationen über eine axiale Bewegung zu extrahieren, ist eine vorherige Kalibrierung der Intensität nichtlinearen Antwort als eine Funktion der axialen Verschiebung zwingend. Beachten Sie, dass für Langzeitmessungen, eine aktive Steuerung der interferometrischen Probe axialen Position ist erforderlich, um die Gültigkeit der Kalibrierungskurve in Gegenwart von thermischen und / oder mechanischen Drifts zu halten.
Die auf trac welche hier HNPse gegen Zellen innerhalb Aggregate werden auf Kaliumniobat Oxid (KNbO 3) auf, aber auch andere zur Verfügung nichtlineare Nanomaterialien sind im Detail in der Arbeit von Staedler et al 16 prüft.
Die nichtlineare optische Effizienz der meisten der bisher untersuchten Nanomaterialien sind sehr vergleichbar. Die Wahl für KNbO 3 wurde im Wesentlichen durch die gute Stabilität der kolloidalen Lösung und ihre gute Biokompatibilität auf mehreren menschlichen Zelllinien auch bei ziemlich hohe Konzentration und lange Expositionszeiten 16 getestet motiviert.
Angesichts der Neuartigkeit der für diese Arbeit eingesetzten Nanomaterialien werden die wichtigsten Merkmale der HNPs im Vergleich zu fluoreszierenden / lumineszierende Biomarker in einer kurzen ursprünglichen Computer-Videoanimation von den Autoren klar gezeigt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Anwendung der Nanotechnologie zur Stammzellforschung ist ein relativ neues, aber rasch wachsenden Bereich. Wie durch verschiedene Übersichtsartikel zu diesem Thema erwähnt, kann die Verwendung von Nanopartikeln verwendet werden, um verschiedene Aufgaben zu erfüllen Forschung, die von Zellverfolgung (sowohl in vitro als auch in vivo), um die intrazelluläre Abgabe von Proteinen und Genen, nicht zuletzt die Schaffung biomimetische zellulären Umgebungen für Vorzugs Stimulation / Hemmung der spezifischen D…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten die teilweise Finanzierung aus dem Europäischen FP7 Forschungsprojekt NAMDIATREAM (NMP4-LA-2010-246479, http://www.namdiatream.eu) und dem INTERREG IV-France Schweiz NAOMI Projekt bestätigen.
Materials
| Microscope Incubator | OKO LAB | UNO package (top stage) | 37°C, 5% CO2, moisturized |
| Multiphoton microscope | Nikon | AR1-MP | |
| Fast scanning, four non photomultiplier descanned detectors | |||
| Filters SHG and autofluorescence | Semrock | FF01-360/12-25 | |
| FF01-395/11-25 | |||
| FF02-485/20-25 | |||
| Microscope objectives | Nikon | CFI Plan Fluor 10x | NA 0.30, WD 16 mm |
| CFI Plan Apo 20x | NA 0.75, WD 1.0 mm, VC | ||
| CFI Apo 40x | NA 1.25, WD 0.18mm λS, Nano-Crystal Coat | ||
| Rhock inhibitor | Sigma | Y-27632 | |
| Knockout DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| Knockout Serum | Invitrogen | 10828 | |
| MEM Non-Essential Amino Acids | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200mM | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | Sigma | M7522 | |
| Collagenase IV | Gibco | 17104-019 | |
| Roller scraper tool | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell system | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| 6-well plates | Falcon | 353046 | |
| 24-well plates | Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) filters | Millipore | NA76/25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
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