Kvantifiering av bröstcancer Cell Invasivt hjälp av en tredimensionell (3D) Modell
Summary
Den här artikeln innehåller detaljerade metoder för användning av tredimensionella (3D) analyser för att kvantifiera bröstcancercellinvasion. Specifikt diskuterar vi de förfaranden som krävs för att upprätta sådana analyser, kvantifiering och analys av data, samt metoder för att undersöka förlusten av membranintegritet som uppstår när celler invaderar.
Abstract
Det är nu väl känt att den cell-och vävnadsmikromiljö är viktiga regulatorer som påverkar tumör initiering och progression. Dessutom har den extracellulära matrisen (ECM) visat sig vara en kritisk regulator av cellbeteende i kultur och homeostas in vivo. Den nuvarande strategin för att odla celler på tvådimensionell (2D), plastytor leder till störningar och förlust av komplexa interaktioner mellan celler och deras mikromiljö. Genom att använda tredimensionella (3D) kulturanalyser, är villkoren för cell-mikromiljö interaktion etablerat liknar in vivo mikromiljö. Denna artikel ger en detaljerad metod för att odla bröstcancerceller, i en 3D-basalmembran proteinmatris, som exemplifierar potentialen av 3D-kultur i bedömningen av cellinvasion in i den omgivande miljön. Dessutom diskuterar vi hur dessa 3D-analyser har potential att undersöka förlusten av signal molecmoduler som reglerar epitelial morfologi genom immunfärgning förfaranden. Dessa studier stöd för att identifiera viktiga mekanistiska detaljerna i de processer som reglerar invasion, som krävs för spridningen av bröstcancer.
Introduction
Migration och invasion av individuella eller kollektiva celler är två kännetecken för cancer, och som krävs för metastatisk spridning av cancerceller 1-4. Förmågan hos cancerceller för att initiera metastas beror på deras förmåga att migrera och invadera in i angränsande vävnad med hjälp invadopodia att degradera basalmembranet hos cellerna. Invadopodia är dynamiska aktin rika matrisnedbrytning utsprång som möjliggör nedbrytning av den extracellulära matrisen genom frisättning av matrixnedbrytande proteaser 5. Cancer cellinvasion innebär nedbrytningen av matrisen följt av migrationen av cancerceller och detta åtföljs av en omorganisation av den tredimensionella (3D) matris miljö 2. Således, för att tränga in genom matrisen måste en cell transformera dess form och interagerar med den extracellulära matrisen (ECM) 2.
Underhållet av bröstvävnad integritet är beroende av tätt controlled vävnadsarkitektur eftersom cell-ECM-och cell-cellvidhäftnings korsningar påverka genuttryck och söndring av epitelial polaritet kan leda till uppkomsten av cancer 6-10. Men de flesta vitro migration och invasion analyser i t.ex. Transwell kammar analyser eller sår-skrap analyser är tvådimensionell (2D) och därmed dessa försummar de intrikata samspelet mellan celler och deras intilliggande miljö 3,6,8,11-14. Betydande morfologiska och funktionella skillnader inklusive variationer i cellulär morfologi, celldifferentiering, cell-matrix sammanväxningar och genexpressionsmönster har upptäckts genom att odla celler i 3D kulturer som ofta saknas i 2D-analyser 2,6,8,11. Således använder 3D-analyser är betydligt nytta i rekapitulera ett mer fysiologiskt in vivo tillstånd, vilket leder till en bättre översättning av banbrytande rön inom grundforskning till kliniken 6-10. Emellertid bör det noteras, Trots de många fördelar som uppnås med hjälp av 3D-kulturer, kan denna modell inte fångar alla de komplexa in vivo tumörmikromiljö som inkluderar olika celltyper. Emellertid är det möjligt att inkorporera stromaceller in i 3D-modeller (t.ex. fibroblaster, leukocyter och makrofager) för att studera effekten av tumör-stroma interaktioner på cancer cell adhesion och invasion 15-17.
Bröst epitelceller i kultur växer mest effektivt när ECM-proteiner såsom laminin och kollagen är närvarande. Med denna kända, har ett kommersiellt tillgängligt matrisblandning härletts från Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) mus tumör och är känd som Matrigel basalmembranmatris 2,8. Ett antal tekniker har inrättats för att odla epitelceller som 3D-kolonier i basalmembran matris 2,8. 3D basalmembranet matrismodellen är effektiv för att fastställa både maligna och icke-maligna bröstcelltillväxt, som liknar det som förekommer i miljön in vivo 18,19. MCF10A cellerna är icke-maligna bröstepitelceller. När den odlas i basalmembranet matris, dessa celler uppvisar in vivo egenskaper hos normala bröstceller och genomgå kontrollerad cellproliferation, cell polarisation, och apoptos för att upprätta lumen utrymme 8,12,20. Dessutom uppkomsten av cellkärnor i MCF10A celler som bildar acini i 3D kulturer mer liknar de av bröst epitelceller i vävnad än de som odlas i monolager 21. Studier av Bissell och kollegor var de första att avslöja att elakartade bröstceller kan skiljas från icke-maligna bröstceller när de odlas i ett laminin rika omgivning, eftersom de maligna celler visar en mycket oorganiserad fenotyp, ökad spridning, minskad cell-till- cellvidhäftning, ökad expression av mesenkymala markörer och en ökning av antalet invasiva struktur bildad 3,6,22.
Avvikelser i cellmiljön kan påverka tumörbildning 20. 3D odlingsmetoden kan användas för att effektivt studera den kommunikation som sker mellan tumörceller och den omgivande miljön och bestämma hur proteinuttrycks influenser kommunikation 14,20,21,23. Den här artikeln innehåller en detaljerad metod för att växa MDA-MB-231 bröstcancerceller i 3D-kulturer för att analysera invasiv, och att studera förlusten av epitelial morfologi med hjälp av en epitelial markör laminin, en komponent i cellbasalmembranet 18,19,24, 25. De detaljerade förfarandena ger möjlighet att exakt och reproducerbart kvantifiera stellate (invasiv) strukturbildning av någon invasiv cancer cell och är inte begränsande till de vanligaste bröstcancercellinjer (t.ex. MDA-MB-231, Hs578T, MCF-7, eller T47D ). Sålunda kan denna analys användas som en plattform för att utvärdera hur proteinuttryck i celler eller behandling med pro-eller anti-invasiva föreningar reglerar extracellulärmatrix nedbrytning, genom en eller flera celler.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utvecklingen av 3D cellodlingsteknik har gjort det möjligt för forskare att studera omvandlingen av bröst epitelceller, vilket tillåter oss att visualisera de dramatiska morfologiska förändringar. Förutom att analysera cellinvasion, kan de enskilda eller flercelliga bröstepitelialceller spheroids användas för att bedöma förändringar i cellulär adhesion, proliferation, storlek, och basal-apikala polaritet. Till skillnad från tidigare rapporterade metoder där cellerna med ECM 8, bäddar in vår …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was conducted with funds to M.B. from the Canadian Institutes of Health Research (CIHR) grant MOP 107972. M.B. is a recipient of a CIHR New Investigator Salary Award. D.C. is a recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit and the CIHR Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer, London Regional Cancer Program. C.G. is recipient of studentships from the Translational Breast Cancer Research Unit, London Regional Cancer Program and from the CIHR- Strategic Training Program in Cancer Research and Technology Transfer. SGD.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| 1.5 mL tubes | VWR | CA10011-700 | Sterile, disposable |
| 100-mm culture dish BD353003 | VWR | CABD353003 | Sterile, disposable |
| 15 mL Falcon tube | VWR | CA21008-918 | Sterile, disposable |
| 1 mL filtered tips | VWR | 10011-350 | Sterile, disposable |
| 200 uL filtered tips | VWR | 22234-016 | Sterile, disposable |
| 20 uL filtered tips | VWR | 22234-008 | Sterile, disposable |
| 35-mm glass-bottomed Confocal No.1 culture dishes | MatTek Corporation | P35G-1.0-14-C | Precooled before use |
| Bovine serum albumin (BSA) | BioShop | ALB003.100 | Used at 3% for IF |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG (H+L) Antibody, highly cross-adsorbed | Life Technologies | A11029 | 1:250 for IF |
| Alexa Fluor 568 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Antibody | Life Technologies | A11011 | 1:1200 for IF |
| Anti-Beta-Catenin | BD Transduction Laboratories | 610153 | Mouse-monoclonal; Used at 1:100 for IF |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F1051 | Used at 10% (v/v) |
| Hoechst 33258, Pentahydrate (bis-Benzimide) – 10 mg⁄mL Solution in Water | Life Technologies | H3569 | Used at 0.1% (1:10000 dilution) |
| InVivo Analyzer Suite | Media Cybernetics | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Kisspeptin-10 (KP-10) | EZ Biolabs | PT0512100601 | Used at 100nM |
| Anti-Laminin | Cedarlane | AB19012(CH) | Rabbit-polyclonal full length human; Used at 1:100 for IF |
| LSM-510 META laser scanning microscope | Zeiss | Used at 63X objective; oil immersion lens | |
| Matrigel phenol red free (BD356237) | VWR | CACB356237 | Lot No.2180819; 10.4 mg/mL |
| Olympus IX-81 microscope | Olympus | Used for 3D culture imaging (DIC images at 10x and 40x) | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Life Technologies | 15140-122 | Antibiotic (added to media; used at 0.01%) |
| 10 mL pipet | VWR | CA53300-523 | Sterile, disposeable |
| RPMI 1640 Medium with Glutamine | Life Technologies | 11875-119 | Used for culturing of MDA-MB-231 cells |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X), Phenol Red | Life Technologies | 25200-072 | Used to trypsinize MDA-MB-231 cells |
| MEGM (bullet kit): MEBM (CC3151)+Single quots (CC4136) | Lonza | CC-3150 | Used for culturing of MCF10A cells |
Referências
- Chambers, A. F., Groom, A. C., MacDonald, I. C. Dissemination and growth of cancer cells in metastatic sites. Nat Rev Cancer. 2, 563-572 (2002).
- Kramer, N., et al. In vitro cell migration and invasion assays. Mutat Res. 752, 10-24 (2013).
- Shaw, K. R., Wrobel, C. N., Brugge, J. S. Use of three-dimensional basement membrane cultures to model oncogene-induced changes in mammary epithelial morphogenesis. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 9, 297-310 (2004).
- Eccles, S. A., Welch, D. R. Metastasis: recent discoveries and novel treatment strategies. Lancet. 369, 1742-1757 (2007).
- Poincloux, R., Lizarraga, F., Chavrier, P. Matrix invasion by tumour cells: a focus on MT1-MMP trafficking to invadopodia. Journal of cell science. 122, 3015-3024 (2009).
- Bissell, M. J., Labarge, M. A. Context, tissue plasticity, and cancer: are tumor stem cells also regulated by the microenvironment. Cancer Cell. 7, 17-23 (2005).
- Burgstaller, G., Oehrle, B., Koch, I., Lindner, M., Eickelberg, O. Multiplex Profiling of Cellular Invasion in 3D Cell Culture Models. PLoS One. 8, (2013).
- Debnath, J., Muthuswamy, S. K., Brugge, J. S. Morphogenesis and oncogenesis of MCF-10A mammary epithelial acini grown in three-dimensional basement membrane cultures. Methods. 30, 256-268 (2003).
- Mroue, R., Bissell, M. J. Three-dimensional cultures of mouse mammary epithelial cells. Methods Mol Biol. 945, 221-250 (2013).
- Vidi, P. A., Bissell, M. J., Lelievre, S. A. Three-dimensional culture of human breast epithelial cells: the how and the why. Methods Mol Biol. 945, 193-219 (2013).
- Bissell, M. J., Rizki, A., Mian, I. S. Tissue architecture: the ultimate regulator of breast epithelial function. Curr Opin Cell Biol. 15, 753-762 (2003).
- Debnath, J., et al. The role of apoptosis in creating and maintaining luminal space within normal and oncogene-expressing mammary acini. Cell. 111, 29-40 (2002).
- Weaver, V. M., Bissell, M. J. Functional culture models to study mechanisms governing apoptosis in normal and malignant mammary epithelial cells. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 4, 193-201 (1999).
- Weaver, V. M., Howlett, A. R., Langton-Webster, B., Petersen, O. W., Bissell, M. J. The development of a functionally relevant cell culture model of progressive human breast cancer. Semin Cancer Biol. 6, 175-184 (1995).
- Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells to the omentum. Int J Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
- Cougoule, C., et al. Blood leukocytes and macrophages of various phenotypes have distinct abilities to form podosomes and to migrate in 3D environments. European journal of cell biology. 91, 938-949 (2012).
- Sung, K. E., et al. Understanding the Impact of 2D and 3D Fibroblast Cultures on In Vitro Breast Cancer Models. PLoS One. , (2013).
- Li, T. T., et al. Beta-arrestin/Ral signaling regulates lysophosphatidic acid-mediated migration and invasion of human breast tumor cells. Mol Cancer Res. 7, 1064-1077 (2009).
- Zajac, M., et al. GPR54 (KISS1R) transactivates EGFR to promote breast cancer cell invasiveness. PLoS One. 6, (2011).
- Underwood, J. M., et al. The ultrastructure of MCF-10A acini. J Cell Physiol. 208, 141-148 (2006).
- Lelievre, S. A., et al. Tissue phenotype depends on reciprocal interactions between the extracellular matrix and the structural organization of the nucleus. Proc Natl Acad Sci U S A. 95, 14711-14716 (1998).
- Petersen, O. W., Ronnov-Jessen, L., Howlett, A. R., Bissell, M. J. Interaction with basement membrane serves to rapidly distinguish growth and differentiation pattern of normal and malignant human breast epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 9064-9068 (1992).
- Weaver, V. M., et al. beta4 integrin-dependent formation of polarized three-dimensional architecture confers resistance to apoptosis in normal and malignant mammary epithelium. Cancer Cell. 2, 205-216 (2002).
- Cvetkovic, D., et al. KISS1R Induces Invasiveness of Estrogen Receptor-Negative Human Mammary Epithelial and Breast Cancer Cells. Endocrinology. , 1999-2014 (2013).
- Alemayehu, M., et al. beta-Arrestin2 regulates lysophosphatidic acid-induced human breast tumor cell migration and invasion via Rap1 and IQGAP1. PLoS One. , (2013).
