Um ensaio para a lateral de Regeneração de Linha em Zebrafish Adulto

Summary

Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudadas no peixe adulto, em vez de o embrião / larvas, foi desenvolvido um ensaio quantitativo regenerativa linha lateral, que pode ser aplicada aos modelos de doenças de peixes-zebra adultos. O ensaio envolveu a resolução neuromasto 1) e 2) os níveis de células de cabelo individuais.

Abstract

Devido à importância clínica da audição e no equilíbrio do homem, de organismos-modelo, como o peixe-zebra foram usados ​​para estudar o desenvolvimento da linha lateral e regeneração. O peixe-zebra é particularmente atraente para tais estudos por causa de seu tempo de desenvolvimento rápido e sua alta capacidade de regeneração. Até o momento, os estudos de peixe-zebra de regeneração da linha lateral têm utilizado principalmente peixes dos estágios embrionários e larvais por causa do menor número de neuromastos nestes estágios. Isso fez com que a análise quantitativa da linha de regeneração e / ou mais fácil o desenvolvimento nas fases de desenvolvimento anteriores lateral. Porque muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas são estudados os peixes adultos e não no embrião / larvas, que focada no desenvolvimento de um ensaio quantitativo linha regenerativa lateral, no peixe-zebra adultos de modo que um ensaio estava disponível que poderia ser aplicada a corrente modelos de doenças zebrafish adultos. Construir em estudos anteriores por Van Trump et al. ^17, que descreve os procedimentos de ablação de células ciliadas adulto mexicano peixes cegos da caverna e peixe-zebra (Danio rerio), nosso ensaio foi concebido para permitir a comparação quantitativa entre os grupos controle e experimentais. Isto foi conseguido através do desenvolvimento de uma curva padrão neuromasto regenerativo com base na percentagem de reaparecimento neuromasto ao longo de um período de tempo de 24 horas a seguir a necrose induzida por gentamicina de células ciliadas em uma região definida da linha lateral. O ensaio também foi concebida para permitir a extensão da análise ao nível da célula individual do cabelo quando é necessário um elevado nível de resolução.

Introduction

A linha lateral sistema (LL) é um órgão mecanosensorial encontrado em ambos os peixes e anfíbios que é responsável pela audição, equilíbrio, reotaxia e comportamentos de mediação, tais como escolaridade e evitar predadores ^1-5. É composta de agregados de células ciliadas rodeadas por células de suporte, os quais estão posicionados em estruturas chamadas neuromastos ^6. Estes neuromastos são normalmente organizados em linhas verticais (chamados pontos) ao longo do eixo longitudinal do corpo e cauda com alguns pontos horizontais observados na cabeça do peixe. No adulto, neuromastos são significativamente maiores em número dentro dos pontos em comparação com as de peixes embrionários ou larvar ^6. Estudos biomédicos no peixe-zebra têm-se centrado sobre o efeito do tratamento com antibióticos, trauma induzida por ruído, infecção crônica, etc. em células ciliadas ^7,8, numa tentativa de compreender melhor os seus efeitos nos seres humanos.

Diferentemente da maioria dos vertebrados, teleosts, tais como peixe-zebra (Danio rerio), têm a capacidade de regenerar células capilares perdidas. Peixe-zebra são particularmente úteis por causa do seu tempo de desenvolvimento rápido e elevada capacidade regeneradora. Até o momento, no entanto; estudos sobre o desenvolvimento de peixe zebra linha lateral e / ou regeneração têm utilizado principalmente o peixe estágio embrionário e larval, devido ao número reduzido de neuromastos linha lateral que facilita a contagem e análise ^6,9,10.

No entanto, como muitos modelos de peixe-zebra de doenças neurológicas e não neurológicas ^11-16 são estudadas no peixes adultos e as larvas não, nós nos concentramos no desenvolvimento de um ensaio de regeneração da linha lateral no peixe-zebra adulto usando gentamicina (um aminoglicosídeo usado anteriormente em larvas do peixe e mais recentemente usado com peixe adulto ^17), de modo que um ensaio estava disponível que poderia ser aplicada para adultos modelos actuais de doenças de peixes-zebra. Embora os procedimentos publicados anteriormente por Van Trump et al. ¹⁷ estabeleceu as condições para a ablação de células ciliadas no peixe adulto, eles não estabelecer uma curva padrão para a regeneração neuromasto que é necessário para comparação quantitativa entre os grupos controle e experimentais, como a utilização de linhas de zebrafish transgênicos ou estados patológicos induzidos farmacologicamente em peixes-zebra ^18. Por isso, seguiu os procedimentos de Van Trump et al. ¹⁷ para ablação de células ciliadas, mas construída sobre o seu trabalho para estabelecer uma curva padrão de regeneração neuromasto para permitir aos investigadores usar os nossos dados ao comparar os grupos controle e experimentais, tais como modelos de doenças com peixe-zebra adulto . O ensaio também foi concebida para permitir a extensão da análise para a célula de cabelo individual, quando é necessário um elevado nível de resolução.

Protocol

Todos os procedimentos são realizados seguindo as diretrizes descritas em "Princípios de Laboratório Animal Care" (Institutos Nacionais de Saúde não publicação. 85-23, revisado em 1985) e do protocolo de animais Comitê Institucional Animal Care e Use Rosalind Franklin University aprovado 08-19. 1. Gentamicina-indução de necrose das células do cabelo Prepare de sulfato de gentamicina em solução salina normal com uma concentração final de 0,004% (4,32 mM). <…

Representative Results

Otimização dos procedimentos para quantificar a regeneração neuromasto da linha lateral no peixe-zebra adulto. Os neuromastos de zebrafish larval são facilmente quantificáveis; no entanto, a linha lateral do peixe-zebra adulto tem um número muito maior de neuromastos por ponto fazendo análises quantitativas mais difícil 6,17,19,20. Como visto na Figura 1A, a cabeça tem um número significativamente maior de neuromastos comparação com q…

Discussion

Com base no extenso corpo de literatura que foi estabelecido para a análise da linha lateral (LL) em regeneração embrionário e larval do peixe-zebra ^8,24,25, o objetivo de nosso estudo foi o desenvolvimento de um ensaio quantitativo para a regeneração da linha lateral em peixes-zebra que poderia ser aplicada aos modelos de doenças que são mais bem estudados no peixe adulto. Descobrimos que certos pontos críticos são importantes quando se aplica procedimentos desenvolvidos para peixes embrionário / …

Materials

Gentamicin sulfate solution (50mg/ml)	Sigma Aldrich	G1397
2 Phenoxyethanol	Sigma Aldrich	P1126
4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp)	Aldrich	D-3418	485 nm excitation λ and 603 nm emission λ
in methanol
6 well plates	Mid Sci	TP92006
Petri Dishes	Fisher Scientific	08-757-13
Glass Bottom Microwell Dishes	Matek Corporation	P35G-1.5-14-C
Sodium Chloride	Sigma Aldrich	S3014
Dissecting  Microscope	Nikon	TMZ-1500	Any dissecting microscope is fine.
Camera for Imaging	Nikon	Q imaging	Any camera is suitable.
Image J software	National Institutes of Health	NIH Image
NIS Elements	Nikon		Any imaging software is suitable.
Confocal microscope	Olympus	FV10i	Any high resolution fluorescent microscope is suitable
Aquatic System	KG Aquatics ZFS Rack System.		Any aquatic system can be used