على الفحص لتجديد الخط الجانبي في اسماك الزرد الكبار
Summary
لأنه يتم دراسة العديد من النماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية في الأسماك البالغة بدلا من الجنين / اليرقات، وضعنا كمية الجانبي الخط التجديدي الفحص التي يمكن تطبيقها على نماذج المرض الزرد الكبار. تشارك مقايسة القرار في 1) neuromast و2) مستويات خلية الشعر الفردية.
Abstract
نظرا لأهمية سريرية السمع واضطرابات التوازن في الإنسان والكائنات نموذج مثل الزرد وقد استخدمت لدراسة تطوير وتجديد الخط الجانبي. الزرد هو جاذبية خاصة لمثل هذه الدراسات لما له من وقت التطوير السريع والقدرة العالية على التجدد. حتى الآن، وقد استخدمت الدراسات الزرد الوحشي من خط التجديد أساسا الأسماك من المراحل الجنينية واليرقات بسبب انخفاض عدد neuromasts في هذه المراحل. جعلت هذا التحليل الكمي من الخط الجانبي تجديد / أو تطوير وأسهل في المراحل التنموية السابقة. لأنه يتم دراسة العديد من النماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية في الأسماك البالغة وليس في الجنين / اليرقات، ركزنا على تطوير الكمي الأفقي خط التجدد مقايسة في الزرد الكبار بحيث كان الفحص المتاحة التي يمكن تطبيقها على الحالي نماذج المرض الزرد الكبار. بناء على الدراسات السابقة من قبل فان Trumع وآخرون 17 التي وصفت إجراءات الاجتثاث من خلايا الشعر في الكبار المكسيكية الأسماك العمياء الكهف والزرد (دانيو rerio)، وقد صمم الاختبار لدينا للسماح المقارنة الكمية بين السيطرة والمجموعات التجريبية. وقد تحقق هذا من خلال تطوير منحنى القياسية neuromast التجدد على أساس المئة من ظهور neuromast على مدى فترة زمنية 24 ساعة التالية نخر الناجم عن جنتاميسين من خلايا الشعر في منطقة محددة من الخط الجانبي. وقد تم تصميم الفحص أيضا للسماح بتمديد التحليل إلى مستوى خلية الشعر الفرد عندما يطلب إلى مستوى أعلى من القرار.
Introduction
الخط الجانبي (LL) هو نظام الجهاز ميكانيكية حسية وجدت في كل من الأسماك والبرمائيات هي المسؤولة عن السمع والتوازن والتوسط انجذاب تياري والسلوكيات مثل التعليم وتجنب الحيوانات المفترسة 1-5. وتتكون من مجموعات من الخلايا محاطة خلايا الشعر الداعمة، وكلاهما المتمركزة في هياكل ودعا neuromasts 6. ويتم تنظيم هذه neuromasts عادة في خطوط عمودية (وتسمى غرزة) على طول المحور الطولي للجسم والذيل مع بعض الغرز الأفقي لوحظ في الرأس من الأسماك. في الكبار، neuromasts هي أكبر بكثير في عدد الغرز داخل بالمقارنة مع الجنينية أو اليرقات السمكية 6. وقد ركزت الدراسات الطبية الحيوية في الزرد على تأثير العلاج بالمضادات الحيوية، والصدمات النفسية الناجمة عن الضوضاء، والعدوى المزمنة، الخ. على خلايا الشعر 7،8 في محاولة لفهم أفضل لآثارها في البشر.
وخلافا لمعظم الفقاريات، الشركة المصرية للاتصالاتleosts، مثل الزرد (دانيو rerio)، لديها القدرة على تجديد خلايا الشعر المفقودة. الزرد هي مفيدة بشكل خاص بسبب وقتهم التطور السريع والقدرة على التجدد عالية. حتى الآن، ولكن؛ وقد استخدمت الدراسات الزرد على تطوير الخط الجانبي و / أو تجديد أساسا الأسماك واليرقات المرحلة الجنينية بسبب انخفاض عدد neuromasts الخط الجانبي الذي يسمح لتسهيل الفرز والتحليل 6،9،10.
ومع ذلك، يتم دراسة العديد من نماذج الزرد من الأمراض العصبية وغير العصبية 11-16 في الأسماك البالغة وليس اليرقات، ركزنا على تطوير التجدد فحص الخط الجانبي في الزرد الكبار باستخدام الجنتاميسين (أمينوغليكوزيد المستخدمة سابقا في اليرقات الزرد و تستخدم في الآونة الأخيرة مع الأسماك البالغة 17) بحيث كان الفحص المتاحة التي يمكن تطبيقها على الكبار نماذج المرض الزرد الحالي. في حين نشرت سابقا الإجراءات التي كتبها فان ترامب هر آل 17 التي أنشئت شروط الاجتثاث خلية الشعر في الأسماك البالغة، إلا أنها لم تنشئ المنحنى القياسي لتجديد neuromast وهو مطلوب للمقارنة كمية بين السيطرة والمجموعات التجريبية مثل عند استخدام خطوط الزرد المعدلة وراثيا أو الحالات المرضية التي يسببها عقاقيري- في الزرد 18. وبالتالي فإننا الإجراءات المتبعة فان ترامب وآخرون (17) لالاجتثاث خلية الشعر، ولكن مبنية على عملهم لإنشاء منحنى القياسية للتجديد neuromast لتمكين الباحثين لاستخدام البيانات المتوفرة لدينا عند مقارنة الضابطة والتجريبية مثل مع نماذج مرض الزرد الكبار . وقد تم تصميم الفحص أيضا للسماح بتمديد التحليل إلى خلية الشعر الفردية عندما يكون مطلوبا مستوى أعلى من القرار.
Protocol
Representative Results
Discussion
استنادا إلى مجموعة كبيرة من المؤلفات التي أنشئت لتحليل الخط الجانبي (LL) في تجديد الجنينية واليرقات الزرد 8،24،25، كان الهدف من دراستنا لوضع مقايسة الكمية لتجديد خط الجانبي في الزرد التي يمكن أن يتم تطبيقها على نماذج المرض التي من الأفضل أن تدرس في الأسماك البالغة…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| in methanol | |||
| 6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |
References
- Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates. Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).
- Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. Sensory Processing of Water Currents by Fishes. Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish. Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).
- Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line. Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line. PloS One. 7 (5), e36661 (2012).
- Raible, D. W., Kruse, G. J. Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish. J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).
- Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line). J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration. Brain Res. 1277, 12-23 (2009).
- Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The Zebrafish As a Model for Cancer. Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics. BMC. Neurosci. 11, (2010).
- Mathur, P., Guo, S. Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and. Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).
- Ignatius, M. S., Langenau, D. M. Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal. Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).
- Milan, D. J., MacRae, C. A. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).
- Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System. Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).
- Littleton, R. M., Hove, J. R. Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line). PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).
- Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected. J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).
- Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies. Ichthyol Res. , 286-290 (2012).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals. The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways. Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).
- Herrera, A. A., Banner, L. R. The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles. J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).
- Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass, ., L, N. Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa. Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus. Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).
