Un test pour ligne latérale de régénération à l'âge adulte de poisson zèbre
Summary
Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes plutôt que l'embryon / larve, nous avons développé un dosage latéral de régénération de ligne quantitative qui peut être appliquée à des modèles de maladies de poisson zèbre adulte. Le dosage impliqué résolution au neuromastes 1) et 2) les niveaux cellulaires de cheveu.
Abstract
En raison de l'importance clinique de l'ouïe et troubles de l'équilibre chez l'homme, des organismes modèles tels que le poisson zèbre ont été utilisés pour étudier le développement de la ligne latérale et la régénération. Le poisson zèbre est particulièrement intéressante pour ces études en raison de son temps de développement rapide et sa grande capacité de régénération. À ce jour, les études de poisson zèbre de latéral régénération de ligne ont principalement utilisé des poissons des stades embryonnaires et larvaires en raison de la diminution du nombre de neuromastes à ces stades. Cela a fait de l'analyse quantitative de la ligne de régénération / et ou le développement plus facile dans les premiers stades de développement latéral. Parce que de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques sont étudiés dans les poissons adultes et non dans l'embryon / larves, nous nous sommes concentrés sur le développement d'un test latéral quantitative ligne de régénération chez le poisson zèbre adulte ainsi qu'une analyse était disponible qui pourrait être appliquée à courant modèles de la maladie de poisson zèbre adulte. S'appuyant sur des études précédentes par Van Trump et al 17. qui décrit les procédures d'ablation de cellules ciliées de poissons adultes mexicain aveugle de la grotte et le poisson zèbre (Danio rerio), notre test a été conçu pour permettre une comparaison quantitative entre les groupes témoins et expérimentaux. Cela a été réalisé en mettant au point une courbe étalon de neuromastes régénérative sur la base de la réapparition de neuromastes pour cent pendant une période de temps de 24 heures suivant la nécrose induite par la gentamicine, de cellules ciliées dans une région définie de la ligne latérale. L'essai a également été conçu pour permettre l'extension de l'analyse au niveau des cellules ciliées individu quand un niveau supérieur de résolution est requise.
Introduction
Le système (LL) de la ligne latérale est un organe mécanosensorielle trouvé dans les deux poissons et les amphibiens qui est responsable de l'audition, l'équilibre, rhéotactisme et les comportements de médiation telles que la scolarisation et l'évitement des prédateurs 1-5. Elle est composée de grappes de cellules ciliées entourées par des cellules de soutien, qui sont tous deux positionnés dans des structures appelées neuromastes 6. Ces neuromastes sont généralement organisés en lignes verticales (appelé points) le long de l'axe longitudinal du corps et de la queue avec quelques points horizontaux observés dans la tête du poisson. Chez l'adulte, neuromastes sont beaucoup plus nombreux dans les points par rapport à l'embryon ou larves de poissons 6. Études biomédicales chez le poisson zèbre ont porté sur l'effet du traitement antibiotique, traumatisme induit par le bruit, une infection chronique, etc. sur les cellules ciliées 7,8 pour tenter de mieux comprendre leurs effets sur les humains.
Contrairement à la plupart des vertébrés, teleosts, tels que le poisson zèbre (Danio rerio), ont la capacité de régénérer les cellules de cheveux perdus. Poisson zèbre sont particulièrement utiles en raison de leur temps de développement rapide et de haute capacité de régénération. A ce jour, toutefois, études de poisson zèbre sur le développement et / ou la régénération de la ligne latérale ont principalement utilisé le poisson embryonnaire et larvaire stade en raison de la réduction du nombre de neuromastes de la ligne latérale qui permet de faciliter le comptage et l'analyse 6,9,10.
Cependant, comme de nombreux modèles de poisson zèbre de maladies neurologiques et non neurologiques 11-16 sont étudiés dans les poissons adultes et non les larves, nous nous sommes concentrés sur le développement d'un test de régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre adulte en utilisant la gentamicine (un aminoglycoside déjà utilisé dans les larves de poisson zèbre et plus récemment utilisé avec les poissons adultes 17) de sorte qu'une analyse était disponible qui pourraient être appliquées à des modèles de maladies adultes actuels de poisson zèbre. Bien que les procédures précédemment publié par Van Trump et al. 17 fixe les conditions pour l'ablation des cellules ciliées dans les poissons adultes, ils n'ont pas établi une courbe standard pour la régénération neuromastes qui est nécessaire pour la comparaison quantitative entre les groupes témoins et expérimentaux tels que l'utilisation de lignes de poisson zèbre transgénique ou états pathologiques pharmacologiquement induits chez le poisson zèbre 18. Nous avons donc suivi les procédures de Van Trump et al. 17 pour l'ablation des cellules ciliées, mais construit sur leur travail pour établir une courbe standard de régénération neuromastes pour permettre aux enquêteurs d'utiliser nos données lorsque l'on compare les groupes témoins et expérimentaux tels que des modèles de la maladie de poisson zèbre adulte . L'essai a également été conçu pour permettre l'extension de l'analyse à la cellule individuelle lorsque les cheveux un plus haut niveau de résolution est requise.
Protocol
Representative Results
Discussion
Basé sur le vaste corpus de littérature qui a été mis en place pour l'analyse de la ligne latérale (LL) de la régénération chez le poisson zèbre embryonnaire et larvaire 8,24,25, le but de notre étude était de développer un dosage quantitatif pour la régénération de la ligne latérale chez le poisson zèbre qui pourrait être appliquée à des modèles de maladies qui sont les mieux étudiés dans les poissons adultes. Nous avons constaté que certains points critiques sont importantes lors…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| in methanol | |||
| 6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |
Referências
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