Ein Test für Laterallinie Regeneration im erwachsenen Zebrafisch
Summary
Da viele Zebrafisch-Modellen der neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen sind in der erwachsenen Fischen nicht der Embryo / Larven untersucht, entwickelten wir eine quantitative Seitenlinie regenerative Assay, die erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle angewendet werden können. Der Test beteiligt Beschluss der 1) Neuromasten und 2) einzelne Haarzelle Ebenen.
Abstract
Aufgrund der klinischen Bedeutung von Hör-und Gleichgewichtsstörungen bei Menschen, Modellorganismen wie Zebrafisch wurden zur Seitenlinie Entwicklung und Regeneration zu studieren. Der Zebrafisch ist wegen seiner schnellen Entwicklungszeit und die hohe Regenerationsfähigkeit für solche Untersuchungen besonders attraktiv. Bisher wurden Zebrafisch-Studien Seitenlinie Regeneration vor allem wegen der geringeren Anzahl von Neuromasten in diesen Phasen genutzt Fische der Embryonal-und Larvenstadien. Dies hat quantitative Analyse der Seitenlinie Regeneration und / oder der Entwicklung leichter in den früheren Entwicklungsstadien gemacht. Da viele Zebrafisch Modelle von neurologischen und nicht-neurologischen Krankheiten im erwachsenen Fisch und nicht im Embryo / Larven untersucht, auf die Entwicklung eines quantitativen Seitenlinie regenerative Assay in erwachsenen Zebrafisch konzentrierten wir uns damit wurde ein Assay zur Verfügung, um Strom angelegt werden kann erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle. Aufbauend auf früheren Studien von Van TrumS. et al 17, dass die Verfahren zur Ablation von Haarzellen im erwachsenen mexikanischen blinde Höhlenfische und Zebrafisch (Danio rerio) beschrieben. wurde unser Test zur quantitativen Vergleich zwischen Kontroll-und Versuchsgruppen zu ermöglichen. Dies wurde durch die Entwicklung eines regenerativen Neuromasten Standardkurve, basierend auf dem Prozentsatz der Neuromasten Wieder über einen 24 Stunden Zeitraum nach Gentamicin-induzierte Nekrose von Haarzellen in einem definierten Bereich der Seitenlinie erreicht. Der Assay wurde auch entworfen, um Erweiterung der Analyse auf die einzelnen Haarzellebene, wenn eine höhere Auflösung erforderlich ist, zu ermöglichen.
Introduction
Die Seitenlinie (LL)-System ist ein mechanosensorischen Orgel in beiden Fische und Amphibien, die für Gehör, Gleichgewicht, rheotaxis und vermittelnde Verhaltensweisen wie Schul-und Raubvermeidung 5.1 verantwortlich ist gefunden. Es wird der Cluster von Haarzellen von Stützzellen umgeben sind, sind die beide in Strukturen genannt Neuromasten 6 angeordnet. Diese Neuromasten sind in der Regel in vertikalen Linien entlang der Längsachse des Körpers und der Schwanz mit einigen im Kopf der Fische beobachtet horizontale Stiche organisiert (genannt Stiche). Beim Erwachsenen sind Neuromasten in der Anzahl deutlich größer innerhalb der Stiche im Vergleich zu embryonalen oder Fischlarven 6. Biomedizinische Studien haben in Zebrafisch über die Wirkung der Behandlung mit Antibiotika, lärmbedingtem Trauma, chronische Infektion, usw. konzentriert. Haarzellen auf 7,8 in einem Versuch, besser ihre Wirkung beim Menschen zu verstehen.
Anders als die meisten Wirbeltiere, teleosts wie Zebrafisch (Danio rerio), haben die Fähigkeit, verlorene Haarzellen zu regenerieren. Zebrafische sind wegen ihrer schnellen Entwicklungszeit und hohe Regenerationsfähigkeit besonders geeignet. Bis heute ist jedoch; Zebrafisch-Studien an der Seitenlinie Entwicklung und / oder der Regeneration haben vor allem die Embryonal-und Larvenstadium Fisch aufgrund der reduzierten Anzahl der Seitenlinie Neuromasten, die für einfachere Zählung und Analyse ermöglicht 6,9,10 genutzt.
Allerdings sind viele Zebrafisch-Modelle von neurologischen und nicht-neurologischen Erkrankungen 11-16 in der erwachsenen Fische und nicht die Larven untersucht, konzentrierten wir uns auf die Entwicklung einer Seitenlinie regenerative Test bei erwachsenen Zebrafisch mit Gentamicin (ein Aminoglykosid zuvor in Zebrafisch-Larven und neuerdings mit 17 erwachsenen Fischen verwendet wird), so dass ein Test zur Verfügung, dass den aktuellen erwachsenen Zebrafisch-Krankheitsmodelle angewandt werden könnten. Während früher durch Van Trump e veröffentlichten Verfahrent al. 17. wurden die Bedingungen für die Haarzell Ablation in der erwachsenen Fische, haben sie nicht eine Standardkurve für Neuromasten, die Regeneration für die quantitative Vergleich zwischen Kontroll-und Versuchsgruppen wie bei der Verwendung von transgenen Zebrafischlinien oder pharmakologisch induzierten Krankheitszuständen erforderlich ist, zu etablieren 18 im Zebrafisch. Wir haben daher die Verfahren, gefolgt von Van Trump et al. Für 17 Haarzelle Ablation, aber auf ihre Arbeit gebaut, um eine Standardkurve von Neuromasten Regeneration Ermittlern ermöglichen, unsere Daten, wie mit erwachsenen Zebrafisch Krankheitsmodelle beim Vergleich Kontroll-und Versuchsgruppen einsetzen . Der Assay wurde auch entworfen, um Erweiterung der Analyse auf die einzelnen Haarzelle zu ermöglichen, wenn eine höhere Auflösung erforderlich ist.
Protocol
Representative Results
Discussion
Basierend auf den umfangreichen Bestand an Literatur, die für die Analyse der Seitenlinie (LL) Regeneration in embryonalen und larvalen Zebrafisch 8,24,25 festgestellt wurde, das Ziel unserer Studie war es, einen quantitativen Test zur Seitenlinie Regeneration im Zebrafisch zu entwickeln, könnte Krankheitsmodelle, die am besten in der erwachsenen Fische untersucht werden angewendet werden. Wir haben festgestellt, dass bestimmte kritische Punkte sind wichtig, wenn Anwendung von Verfahren für die embryonale …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| in methanol | |||
| 6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |
Referências
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