מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.
בשל החשיבות הקלינית של שמיעה והפרעות במאזן באדם, אורגניזמים מודל כגון דג הזברה היו בשימוש ללמוד פיתוח קו לרוחב והתחדשות. דג הזברה היא אטרקטיבי במיוחד עבור מחקרים כאלה, כי הזמן המהיר שלה לפיתוח ויכולת ההתחדשות הגבוהה שלה. עד כה, מחקרי דג הזברה של התחדשות קו לרוחב יש בעיקר מנוצלים דגים של השלבים העובריים וזחל בגלל המספר נמוך יותר של neuromasts בשלבים אלה. זה הפך את ניתוח הכמותי של קו התחדשות / או פיתוח וקל יותר בשלבי ההתפתחות המוקדמים יותר לרוחב. מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא בעובר / הזחלים, אנו מתמקדים בפיתוח assay משובי קו לרוחב כמוני בדג זברה מבוגר, כך שassay היה זמין שיכול להיות מיושם על נוכחית מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. בונה על מחקרים קודמים על ידי ואן מוסטרוםעמ ואח'. 17 שתוארו נהלים לאבלציה של תאי שיער בדגים בוגרים מקסיקנים עיוורים המערה ודג זברה (Danio rerio), assay שלנו נועד לאפשר השוואת כמותית בין שליטה וקבוצות ניסוי. הדבר זה הושג על ידי פיתוח עקומת סטנדרט neuromast משובי המבוססת על אחוזים מהופעתו neuromast על פני תקופה זמן 24 שעות הבאות נמק המושרה גנטמיצין של תאי שיער באזור מוגדר של קו הרוחב. Assay נועד גם כדי לאפשר הרחבה של הניתוח לרמת התא הבודד שיער כאשר רמה גבוהה יותר של רזולוציה נדרשת.
הקו לרוחב המערכת (LL) הוא איבר mechanosensory נמצא בשני דגים ודו חיים, כי הוא אחראי לשמיעה, שיווי משקל, rheotaxis והתנהגויות מתווכות כגון השכלה והימנעות טורף 1-5. הוא מורכב מהאשכולות של תאי שיער מוקפים בתאים תומכים, אשר שניהם ממוקמים במבנים הנקראים neuromasts 6. neuromasts אלה מאורגנים בדרך כלל בקווים אנכיים (שנקרא תפרים) לאורך ציר האורך של הגוף והזנב עם כמה תפרים אופקיים נצפו בראש של הדג. במבוגרים, neuromasts הם גדול יותר באופן משמעותי במספר בתוך התפרים, בהשוואה לדגים עובריים או זחל 6. מחקרים ביו בדג הזברה התמקדו בהשפעה של טיפול אנטיביוטי, טראומה כתוצאה מרעש, זיהום כרוני, וכו '. בתאי שיער 7,8 בניסיון להבין טוב יותר את ההשפעות שלהם בבני אדם.
שלא כמו רוב בעלי חוליות, teleosts, כגון דג הזברה (Danio rerio), יש את היכולת לחדש את תאי שיער שאבדו. דג הזברה הן שימושי במיוחד משום שזמנם לפיתוח המהיר ויכולת התחדשות גבוהה. עד כה, עם זאת; מחקרי דג הזברה בפיתוח קו לרוחב ו / או התחדשות שבעיקר ניצלו את הדגים בשלב העובריים וזחל בשל המספר המופחת של neuromasts קו לרוחב המאפשר לספירה קלה ו6,9,10 ניתוח.
עם זאת, כפי שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות 11-16 נלמדים בדגים הבוגרים ולא הזחלים, אנו מתמקדים בפיתוח assay קו לרוחב משובי בדג זברה מבוגר באמצעות גנטמיצין (aminoglycoside השתמש בעבר בזחלי דג הזברה ו משמש יותר לאחרונה עם דגים בוגרים 17) כך שassay היה זמין שיכול להיות מיושם על מודלים מחלה הנוכחיים למבוגרים דג הזברה. אמנם פורסם בעבר על ידי נהלים ואן טראמפ דוארt אל. 17 הקימו את התנאים לאבלציה של תאי שיער בדגים הבוגרים, הם לא הקימו עקומת סטנדרט להתחדשות neuromast אשר נדרש להשוואת כמותית בין שליטה וקבוצות ניסוי כגון בעת שימוש בקווי דג הזברה מהונדסים או מצבי מחלה פרמקולוגית-induced בדג הזברה 18. לפיכך, אנו פעלנו בהתאם להליכים של ואן טראמפ et al. 17 לאבלציה של תאי שיער, אך בנויים על העבודה שלהם להקים עקומת סטנדרט של התחדשות neuromast כדי לאפשר לחוקרים להשתמש בנתונים שלנו כאשר משווים שליטה וקבוצות ניסוי כגון עם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים . Assay נועד גם כדי לאפשר הרחבה של הניתוח לתא השיער הבודד, כאשר ברמה גבוהה יותר של רזולוציה נדרשת.
בהתבסס על ההיקף הנרחב של ספרות שכבר נקבעה לניתוח של קו לרוחב התחדשות (LL) בדג זברה עוברית וזחל 8,24,25, מטרת המחקר שלנו הייתה לפתח assay כמותיים להתחדשות קו לרוחב בדג זברה שיכל להיות מיושם על מודלים מחלה, כי הם למדו הטובים ביותר בדגים הבוגרים. מצאנו כי נקודות קריטיות מס?…
The authors have nothing to disclose.
The authors have nothing to disclose.
Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
in methanol | |||
6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |