Assay עבור התחדשות קו לרוחב בדג הזברה למבוגר
Summary
מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא את העובר / זחלים, פיתחנו assay כמותיים לרוחב שורת משובי שניתן ליישם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. Assay מעורב רזולוציה בneuromast 1) ו 2) רמות תא שיער בודד.
Abstract
בשל החשיבות הקלינית של שמיעה והפרעות במאזן באדם, אורגניזמים מודל כגון דג הזברה היו בשימוש ללמוד פיתוח קו לרוחב והתחדשות. דג הזברה היא אטרקטיבי במיוחד עבור מחקרים כאלה, כי הזמן המהיר שלה לפיתוח ויכולת ההתחדשות הגבוהה שלה. עד כה, מחקרי דג הזברה של התחדשות קו לרוחב יש בעיקר מנוצלים דגים של השלבים העובריים וזחל בגלל המספר נמוך יותר של neuromasts בשלבים אלה. זה הפך את ניתוח הכמותי של קו התחדשות / או פיתוח וקל יותר בשלבי ההתפתחות המוקדמים יותר לרוחב. מכיוון שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות נלמדים בדגים הבוגרים ולא בעובר / הזחלים, אנו מתמקדים בפיתוח assay משובי קו לרוחב כמוני בדג זברה מבוגר, כך שassay היה זמין שיכול להיות מיושם על נוכחית מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים. בונה על מחקרים קודמים על ידי ואן מוסטרוםעמ ואח'. 17 שתוארו נהלים לאבלציה של תאי שיער בדגים בוגרים מקסיקנים עיוורים המערה ודג זברה (Danio rerio), assay שלנו נועד לאפשר השוואת כמותית בין שליטה וקבוצות ניסוי. הדבר זה הושג על ידי פיתוח עקומת סטנדרט neuromast משובי המבוססת על אחוזים מהופעתו neuromast על פני תקופה זמן 24 שעות הבאות נמק המושרה גנטמיצין של תאי שיער באזור מוגדר של קו הרוחב. Assay נועד גם כדי לאפשר הרחבה של הניתוח לרמת התא הבודד שיער כאשר רמה גבוהה יותר של רזולוציה נדרשת.
Introduction
הקו לרוחב המערכת (LL) הוא איבר mechanosensory נמצא בשני דגים ודו חיים, כי הוא אחראי לשמיעה, שיווי משקל, rheotaxis והתנהגויות מתווכות כגון השכלה והימנעות טורף 1-5. הוא מורכב מהאשכולות של תאי שיער מוקפים בתאים תומכים, אשר שניהם ממוקמים במבנים הנקראים neuromasts 6. neuromasts אלה מאורגנים בדרך כלל בקווים אנכיים (שנקרא תפרים) לאורך ציר האורך של הגוף והזנב עם כמה תפרים אופקיים נצפו בראש של הדג. במבוגרים, neuromasts הם גדול יותר באופן משמעותי במספר בתוך התפרים, בהשוואה לדגים עובריים או זחל 6. מחקרים ביו בדג הזברה התמקדו בהשפעה של טיפול אנטיביוטי, טראומה כתוצאה מרעש, זיהום כרוני, וכו '. בתאי שיער 7,8 בניסיון להבין טוב יותר את ההשפעות שלהם בבני אדם.
שלא כמו רוב בעלי חוליות, teleosts, כגון דג הזברה (Danio rerio), יש את היכולת לחדש את תאי שיער שאבדו. דג הזברה הן שימושי במיוחד משום שזמנם לפיתוח המהיר ויכולת התחדשות גבוהה. עד כה, עם זאת; מחקרי דג הזברה בפיתוח קו לרוחב ו / או התחדשות שבעיקר ניצלו את הדגים בשלב העובריים וזחל בשל המספר המופחת של neuromasts קו לרוחב המאפשר לספירה קלה ו6,9,10 ניתוח.
עם זאת, כפי שרבי דגמי דג הזברה של מחלות נוירולוגיות ושאינן נוירולוגיות 11-16 נלמדים בדגים הבוגרים ולא הזחלים, אנו מתמקדים בפיתוח assay קו לרוחב משובי בדג זברה מבוגר באמצעות גנטמיצין (aminoglycoside השתמש בעבר בזחלי דג הזברה ו משמש יותר לאחרונה עם דגים בוגרים 17) כך שassay היה זמין שיכול להיות מיושם על מודלים מחלה הנוכחיים למבוגרים דג הזברה. אמנם פורסם בעבר על ידי נהלים ואן טראמפ דוארt אל. 17 הקימו את התנאים לאבלציה של תאי שיער בדגים הבוגרים, הם לא הקימו עקומת סטנדרט להתחדשות neuromast אשר נדרש להשוואת כמותית בין שליטה וקבוצות ניסוי כגון בעת שימוש בקווי דג הזברה מהונדסים או מצבי מחלה פרמקולוגית-induced בדג הזברה 18. לפיכך, אנו פעלנו בהתאם להליכים של ואן טראמפ et al. 17 לאבלציה של תאי שיער, אך בנויים על העבודה שלהם להקים עקומת סטנדרט של התחדשות neuromast כדי לאפשר לחוקרים להשתמש בנתונים שלנו כאשר משווים שליטה וקבוצות ניסוי כגון עם מודלים מחלה דג הזברה מבוגרים . Assay נועד גם כדי לאפשר הרחבה של הניתוח לתא השיער הבודד, כאשר ברמה גבוהה יותר של רזולוציה נדרשת.
Protocol
Representative Results
Discussion
בהתבסס על ההיקף הנרחב של ספרות שכבר נקבעה לניתוח של קו לרוחב התחדשות (LL) בדג זברה עוברית וזחל 8,24,25, מטרת המחקר שלנו הייתה לפתח assay כמותיים להתחדשות קו לרוחב בדג זברה שיכל להיות מיושם על מודלים מחלה, כי הם למדו הטובים ביותר בדגים הבוגרים. מצאנו כי נקודות קריטיות מס?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| in methanol | |||
| 6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |
References
- Dambly-Chaudire, C., Sapde, D., Soubiran, F., Decorde, K., Gompel, N., Ghysen, A. The Lateral Line of Zebrafish: a Model System for the Analysis of Morphogenesis and Neural Development in Vertebrates. Biol. Cell. 95 (9), 579-587 (2003).
- Montgomery, J., Carton, G., Voigt, R., Baker, C., Diebel, C. Sensory Processing of Water Currents by Fishes. Phil. Trans. Royal Soc. London B Biol. Sci. 355 (1401), 1325-1327 (2000).
- Buck, L. M., Winter, M. J., Redfern, W., Whitfield, T. T. Ototoxin-Induced Cellular Damage in Neuromasts Disrupts Lateral Line Function in Larval Zebrafish. Hearing Res. 284 (1-2), 1-2 (2012).
- Engelmann, J., Hanke, W., Mogdans, J., Bleckmann, H. Hydrodynamic Stimuli and the Fish Lateral Line. Nature. 408 (6808), 51-52 (2000).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguch, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line. PloS One. 7 (5), e36661 (2012).
- Raible, D. W., Kruse, G. J. Organization of the Lateral Line System in Embryonic Zebrafish. J. Comp. Neurol. 421 (2), 189-198 (2000).
- Coffin, A. B., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Extracellular Divalent Cations Modulate Aminoglycoside-Induced Hair Cell Death in the Zebrafish Lateral. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Ma, E. Y., Rubel, E. W., Raible, D. W. Notch Signaling Regulates the Extent of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral Line). J. Neurosci. 28 (9), 2261-2273 (2008).
- Brignull, H. R., Raible, D. W., Stone, J. S. Feathers and Fins: Non-Mammalian Models for Hair Cell Regeneration. Brain Res. 1277, 12-23 (2009).
- Bibliowicz, J., Tittle, R. K., Gross, J. M. Toward a Better Understanding of Human Eye Disease Insights From the Zebrafish, Danio Rerio. Prog. Mol. Biol. Transl. Sci. 100, 287-330 (2011).
- Mione, M. C., Trede, N. S. The Zebrafish As a Model for Cancer. Dis. Model. Mech. 3 (9-10), 9-10 (2010).
- Norton, W., Bally-Cuif, L. Adult Zebrafish As a Model Organism for Behavioural Genetics. BMC. Neurosci. 11, (2010).
- Mathur, P., Guo, S. Use of Zebrafish As a Model to Understand Mechanisms of Addiction and. Complex Neurobehavioral Phenotypes. Neurobiol. Dis. 40 (1), 66-72 (2010).
- Ignatius, M. S., Langenau, D. M. Zebrafish As a Model for Cancer Self-Renewal. Zebrafish. 6 (4), 377-387 (2009).
- Milan, D. J., MacRae, C. A. Zebrafish Genetic Models for Arrhythmia. Prog. Biophys. Mol. Biol. 98 (2-3), 2-3 (2008).
- Van Trump, W. J., Coombs, S., Duncan, K., McHenry, M. J. Gentamicin Is Ototoxic to All Hair Cells in the Fish Lateral Line System. Hear. Res. 261 (1-2), 1-2 (2010).
- Littleton, R. M., Hove, J. R. Zebrafish: a Nontraditional Model of Traditional Medicine. J. Ethnopharmacol. 145 (3), 677-685 (2013).
- Harris, J. A., Cheng, A. G., Cunningham, L. L., MacDonald, G., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Neomycin-Induced Hair Cell Death and Rapid Regeneration in the Lateral Line of Zebrafish (Danio. 4 (2), 219-234 (2003).
- Olszewski, J., Haehnel, M., Taguchi, M., Liao, J. C. Zebrafish Larvae Exhibit Rheotaxis and Can Escape a Continuous Suction Source Using Their Lateral Line). PLoS One. 7 (5), 36661-36 (2012).
- Liang, J., Wang, D., Renaud, G., Wolfsberg, T. G., Wilson, A. F., Burgess, S. M. The Stat3/Socs3a Pathway Is a Key Regulator of Hair Cell Regeneration in Zebrafish [Corrected. J. Neurosci. 32 (31), 10662-10673 (2012).
- Nakae, M., Asaoka, R., Wada, H., Sasaki, K. Fluorescent Dye Staining of Neuromasts in Live Fishes: An Aid to Systematic Studies. Ichthyol Res. , 286-290 (2012).
- Magrassi, L., Purves, D., Lichtman, J. W. Fluorescent Probes That Stain Living Nerve Terminals. The J. Neurosci. 7 (4), 1207-1214 (1987).
- Owens, K. N., Coffin, A. B., Hong, L. S., Bennett, K. O., Rubel, E. W., Raible, D. W. Response of Mechanosensory Hair Cells of the Zebrafish Lateral Line to Aminoglycosides Reveals Distinct Cell Death Pathways. Hear. Res. 253 (1-2), 1-2 (2009).
- Namdaran, P., Reinhart, K. E., Owens, K. N., Raible, D. W., Rubel, E. W. . Identification of Modulators of Hair Cell Regeneration in the Zebrafish Lateral. 32 (10), 3516-3528 (2012).
- Herrera, A. A., Banner, L. R. The Use and Effects of Vital Fluorescent Dyes: Observation of Motor Nerve Terminals and Satellite Cells in Living Frog Muscles. J. Neurocytol. 19 (1), 67-83 (1990).
- Hickey, P. C., Jacobson, D., Read, N. D., Louise Glass, ., L, N. Live-Cell Imaging of Vegetative Hyphal Fusion in Neurospora Crassa. Fungal. Genet. Biol. 37 (1), 109-119 (2002).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Intine, R. V. Limb Regeneration Is Impaired in an Adult Zebrafish Model of Diabetes Mellitus. Wound Repair Regen. 18 (5), 532-542 (2010).
- Olsen, A. S., Sarras, M. P., Leontovich, A., Intine, R. V. Heritable Transmission of Diabetic Metabolic Memory in Zebrafish Correlates With DNA Hypomethylation and Aberrant Gene Expression. Diabetes. 61 (2), 485-491 (2012).
