Un ensayo para la línea lateral de regeneración en adultos de pez cebra
Summary
Debido a que muchos modelos de pez cebra de enfermedades neurológicas y no neurológicas se estudian en los peces adultos en lugar de el embrión / larvas, hemos desarrollado un ensayo cuantitativo regenerativa línea lateral que se puede aplicar a modelos de enfermedad de pez cebra adultos. El ensayo implicó resolución en el neuromast 1) y 2) los niveles de células cabello individual.
Abstract
Debido a la importancia clínica de la audición y trastornos del equilibrio en el ser humano, los organismos modelo, como el pez cebra se han utilizado para estudiar el desarrollo de la línea lateral y la regeneración. El pez cebra es particularmente atractivo para estos estudios debido a su tiempo de desarrollo rápido y su alta capacidad de regeneración. Hasta la fecha, los estudios de pez cebra de la regeneración de la línea lateral se han utilizado principalmente pescado de las etapas embrionarias y larvarias debido al menor número de neuromastos en estas etapas. Esto ha hecho que el análisis cuantitativo de la línea de la regeneración y / o el desarrollo más fácil en las etapas anteriores del desarrollo lateral. Debido a que muchos modelos de pez cebra de las enfermedades neurológicas y no neurológicas se estudian en los peces adultos y no en el embrión / larvas, nos centramos en el desarrollo de un ensayo de regeneración de la línea lateral cuantitativa en adultos de pez cebra para que un ensayo estaba disponible que podría ser aplicado a la corriente modelos de enfermedad de pez cebra adultos. Sobre la base de estudios previos de Van Trump et al 17. que describe los procedimientos para la ablación de las células ciliadas en peces adultos mexicana ciega cueva y el pez cebra (Danio rerio), nuestro ensayo fue diseñado para permitir la comparación cuantitativa entre el control y los grupos experimentales. Esto se logró mediante el desarrollo de una curva estándar neuromast regenerativa basado en el porcentaje de reaparición neuromast durante un período de tiempo de 24 horas después de la necrosis inducida por la gentamicina de las células ciliadas en una región definida de la línea lateral. El ensayo también fue diseñado para permitir la extensión del análisis a nivel de la célula individual del pelo cuando se requiere un mayor nivel de resolución.
Introduction
La línea lateral del sistema (SD) es un órgano mecanosensorial encontrado en ambos peces y anfibios que se encarga de la audición, el equilibrio, rheotaxis y conductas mediadoras como la escolarización y la evitación de depredadores 1-5. Se compone de grupos de células de pelo rodeado de células de soporte, ambos de los cuales están situados en estructuras llamadas neuromastos 6. Estos neuromastos están organizados típicamente en líneas verticales (llamado puntos) a lo largo del eje longitudinal del cuerpo y la cola con algunos puntos de sutura horizontales observados en la cabeza del pescado. En el adulto, neuromastos son significativamente mayores en número dentro de los puntos de sutura en comparación con los peces de embriones o larvas 6. Estudios biomédicos en el pez cebra se han centrado en el efecto del tratamiento antibiótico, el trauma a causa del ruido, la infección crónica, etc. en células ciliadas 7,8 en un intento de comprender mejor sus efectos en los seres humanos.
A diferencia de la mayoría de los vertebrados, TEleosts, como el pez cebra (Danio rerio), tienen la capacidad de regenerar las células pilosas perdidas. El pez cebra son particularmente útiles debido a su tiempo de desarrollo rápido y de alta capacidad de regeneración. Hasta la fecha, sin embargo; estudios sobre el desarrollo de pez cebra de la línea lateral y / o regeneración han utilizado principalmente el pescado etapa embrionario y larval debido a la reducción del número de neuromastos la línea lateral que permite para el recuento más fácil y análisis 6,9,10.
Sin embargo, se estudian como muchos modelos de pez cebra de las enfermedades neurológicas y no neurológicas 11-16 en el pez adulto y no las larvas, que se centró en el desarrollo de un ensayo de regeneración de la línea lateral en el pez cebra adultos usando gentamicina (un aminoglucósido utilizado anteriormente en larvas de pez cebra y más recientemente utilizado con peces adultos 17) de manera que un ensayo estaba disponible que podría aplicarse a modelos de enfermedad de pez cebra adultos actuales. Mientras que previamente publicado procedimientos de Van Trump et al. 17 establece las condiciones para la ablación de las células ciliadas en los peces adultos, no establecieron una curva estándar para la regeneración neuromast que se requiere para la comparación cuantitativa entre el control y los grupos experimentales, como al utilizar líneas de pez cebra transgénico o estados de enfermedad inducidos farmacológicamente- en el pez cebra 18. Por lo tanto, seguimos los procedimientos de Van Trump et al. 17 para la ablación de las células ciliadas, pero construido sobre sus actividades para crear una curva estándar de la regeneración neuromast para permitir a los investigadores a utilizar nuestros datos cuando se comparan grupos de control y experimentales, como con modelos de enfermedades de pez cebra adultos . El ensayo también fue diseñado para permitir la extensión del análisis a la célula individual del pelo cuando se requiere un mayor nivel de resolución.
Protocol
Representative Results
Discussion
Basado en el extenso cuerpo de literatura que se ha establecido para el análisis de la línea lateral de regeneración (LL) en embriones y larvas de pez cebra 8,24,25, el objetivo de nuestro estudio fue desarrollar un ensayo cuantitativo para la regeneración de la línea lateral en el pez cebra que podrían ser aplicada a modelos de enfermedades que se estudian mejor en los peces adultos. Hemos encontrado que ciertos puntos críticos son importantes en la aplicación de los procedimientos desarrollados para…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors have nothing to disclose.
Materials
| Gentamicin sulfate solution (50mg/ml) | Sigma Aldrich | G1397 | |
| 2 Phenoxyethanol | Sigma Aldrich | P1126 | |
| 4-4-diethylaminostryryl-N-methylpyridinium iodide (4-Di-2-Asp) | Aldrich | D-3418 | 485 nm excitation λ and 603 nm emission λ |
| in methanol | |||
| 6 well plates | Mid Sci | TP92006 | |
| Petri Dishes | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Glass Bottom Microwell Dishes | Matek Corporation | P35G-1.5-14-C | |
| Sodium Chloride | Sigma Aldrich | S3014 | |
| Dissecting Microscope | Nikon | TMZ-1500 | Any dissecting microscope is fine. |
| Camera for Imaging | Nikon | Q imaging | Any camera is suitable. |
| Image J software | National Institutes of Health | NIH Image | |
| NIS Elements | Nikon | Any imaging software is suitable. | |
| Confocal microscope | Olympus | FV10i | Any high resolution fluorescent microscope is suitable |
| Aquatic System | KG Aquatics ZFS Rack System. | Any aquatic system can be used |
Referências
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