Identificación de nuevos genes asociados con alginato producción en<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Uso de Mini-<em> Himar1</em> La mutagénesis mediada por transposón Mariner
Summary
Aquí se describe un protocolo utilizando el navegante mutagénesis-mini Himar1 transposón mediada para generar una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad de la pantalla, aislar e identificar nuevos reguladores de alginato en el prototípico cepa PAO1 Pseudomonas aeruginosa.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria Gram-negativa, del medio ambiente con capacidades metabólicas versátiles. P. aeruginosa es una bacteria patógena oportunista que produce infecciones pulmonares crónicas en pacientes con fibrosis quística (FQ). La sobreproducción de un polisacárido capsular llamado alginato, también conocido como mucoidy, promueve la formación de biopelículas mucoides que son más resistentes que las células planctónicas a la quimioterapia antibiótico y las defensas del huésped. Además, la conversión de la nonmucoid a fenotipo mucoide es un marcador clínico para el inicio de la infección crónica en la FQ. Sobreproducción de alginato por P. aeruginosa es un proceso que en gran medida endergónica impuestos sobre la energía celular. Por lo tanto, la producción de alginato está muy regulada en P. aeruginosa. Para entender mejor la regulación de alginato, se describe un protocolo usando el transposón de mutagénesis de mini-Himar1 para la identificación de nuevos regulador de alginatos en una cepa PAO1 prototípico. El procedimiento consta de dos pasos básicos. En primer lugar, hemos transferido el transposón mini-Himar1 (PFA) del huésped E. coli SM10/λpir en receptor P. aeruginosa PAO1 a través de la conjugación biparental para crear una biblioteca de mutantes de inserción de alta densidad, los cuales fueron seleccionados en placas de agar de Pseudomonas aislamiento suplementado con gentamicina. En segundo lugar, hemos examinado y aislaron las colonias mucoides para asignar el lugar de la inserción a través de PCR inversa usando cebadores de ADN que apuntan hacia el exterior desde el casete de gentamicina y la secuenciación del ADN. El uso de este protocolo, se han identificado dos nuevos reguladores de alginato, Muce (PA4033) y kinB (PA5484), en PAO1 cepa con una de tipo salvaje mucA codifica el factor anti-sigma MUCA para el maestro de alginato regulador AlgU (ALGT, σ 22) . Este protocolo de mutagénesis de alto rendimiento puede ser modificado para la identificación de otros genes relacionados con la virulencia que causa el cambio en Colomorfología ny.
Introduction
La capacidad de la oportunista, patógenos Gram-negativa Pseudomonas aeruginosa para sobreproducir alginato es un factor importante en su capacidad para establecer un biofilm. La sobreproducción de alginato es un fenotipo a menudo referido como mucoidy. El aislamiento de colonias mucosas de los esputos de los individuos que sufren de fibrosis quística (FQ) es indicativo de una infección crónica y se asocia directamente con una disminución general de la salud del paciente 1. En la actualidad, se entiende que la regulación y la producción de alginato en P. aeruginosa se produce principalmente en dos operones. El primero es el operón biosintético de alginato, que contiene 12 genes (algD – Alg8 – Alg44 – algK – Alge – AlgG – Algx – algL – Algi – algJ – algF – alga) que son responsables de la síntesis y la exportación del polímero de alginato través el periplasma para el med extracelularnt 2-5. El segundo operón es un grupo de genes a partir de la alternativa sigma factor AlgU / T y continuando con mucA, mucB y MUCD. AlgU / T es un regulador positivo, mientras que MUCAB-D se clasifican como reguladores negativos de la producción de alginato 6-8. Además, los reguladores transcripcionales, tales como ALGB, AlgQ, ALGR, y RpoN, así como post-transcripcional y post-translacional modificación por el control de la represión catabólica, la actividad quinasa (KinB) y intramembrane proteólisis, también se han demostrado estar involucrados en alginato regulación 9-14.
El vector transposón mini-Himar1 conocida como Comisión PFA fue creado originalmente en el laboratorio del Dr. Mekalanos 'en Harvard Medical School 15. El plásmido PFA consta de un elemento transponible flanqueado por dos repeticiones invertidas de 27 pb y un casete de gentamicina de resistencia en el medio (aacC1: 534 pb), un gen que codifica la hyperactive transposasa Mariner 16, y una codificación de β-lactamasa gen (bla) (Figura 1). Secuencia de la información para el elemento de transposición de la Comisión PFA está disponible en el número de acceso de GenBank: DQ366300 13. En la Comisión PFA, hay un sitio de clonación múltiple (MCS) detrás del gen aacC1 que se utiliza para la identificación del sitio de inserción cromosómica utilizando PCR inversa. Una gran ventaja con el uso del transposón mini-Himar1 es que no se requieren factores del huésped específicos de transposición (mutagénesis). Además, hay una alta abundancia de los sitios de inserción de dinucleótidos TA se encuentran en todo el genoma de P. aeruginosa. Por ejemplo, AT sitios de inserción dinucleótido produce 94.404 y 100.229 veces en el PAO1 (6.264.404 bps, número de acceso GenBank NC_002516.2) y PA14 (6.537.648 bps; número de acceso GenBank NC_008463) genomas, respectivamente. Debido a la abundancia de TA dinucleótido en el genoma, mini-Himar1 </em> Transposón puede causar que el de alta densidad y mutagénesis aleatoria, que es particularmente adecuado para el análisis de genes de virulencia y los genes que están altamente regulados. Teóricamente, el transposón mini-Himar1 puede insertar en cualquier gen no esencial dentro del genoma de P. aeruginosa. Esto proporciona aproximadamente 18 sitios de inserción de asistencia técnica al marco de lectura abierto en el genoma PAO1.
Aquí se describe un protocolo utilizando mini-Himar1 transposón mutagénesis mediada por identificar nuevos reguladores de mucoidy en P. aeruginosa. Más específicamente, biparental conjugamos el vector de la Comisión PFA contiene un transposón mini-Himar1 de E. coli SM10/λpir en el nonmucoid cepa PAO1 prototrophic. Después de que el transposón se integra en el genoma, la cepa receptora se cultiva en Pseudomonas aislamiento agar (PIA) que contiene triclosán que inhibe el crecimiento de E. coli. Por lo tanto, una biblioteca de mutantes de <em> P. aeruginosa puede ser seleccionado por el crecimiento en la placa de PIA suplementado con gentamicina y la presencia del fenotipo mucoide. Tenga en cuenta, un transposón mediada vs un mutante verdadera integración tendrá un fenotipo resistente y carbenicilina sensible gentamicina. En este estudio, aproximadamente 80.000 mutantes de inserción de PAO1 se aislaron a través de cuatro conjugaciones separadas. Hemos examinado a continuación para los aislados mucoides, y se determinó el sitio de inserción por la digestión con enzimas de restricción, ligación y PCR inversa. Se realizó análisis de transferencia de Southern usando la casete de resistencia a gentamicina como una sonda para ver el número de inserción por genoma. Se determinó que más de 90% de los mutantes obtenidos por la conjugación utilizando este protocolo tenía sólo una única copia de la Himar1 en el genoma y se muestra el fenotipo resistente y-carbenicilina sensible gentamicina. Se identificaron un total de 32 cepas mucoides, 22 de ellas fueron asignadas a diferentes loci del P. aeruginosa PAO1cromosoma. Esta tasa de inserción proporciona una cobertura adecuada para identificar varios reguladores novedosos de la sobreproducción de alginato.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es importante señalar que este método se puede utilizar en otras especies de Pseudomonas con estas alteraciones: incubar P. y P. fluorescens putida a 30 ° C, y P. stutzeri a 42 ° C; P. stuzeri debe cultivarse en placas de LB suplementadas con 150 g / ml de gentamicina; en el paso 1,11, p células stutzeri deben transferirse en 500 l de LB en lugar de 1 ml. Además, hay dos pasos críticos para este protocolo. En primer lugar, la cepa receptora debe culti…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por la National Aeronautics and Space Administration West Virginia Espacio de Grant Consorcio (NASA WVSGC), Cystic Fibrosis Foundation (CFF-YU11G0) y NIH P20RR016477 y P20GM103434 a la Red IDEA West Virginia para la Investigación Biomédica de Excelencia. Damos las gracias a M. Vonya Eisinger para la asistencia técnica con este trabajo.
Materials
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
Referências
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).. J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O’Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
