Alginat içinde üretimi ile ilişkili yeni genlerin tanımlanması<em> Pseudomonas aeruginosa</emKullanma> Mini-<em> Himar1</em> Mariner Transposon dolayımlı mutagenez
Summary
Burada, ekrana yüksek yoğunluklu ekleme mutant kütüphanesi oluşturmak için mini-transpozon himar1 mariner dolayımlı mutagenez kullanılarak bir protokol açıklar izole edilmesi ve prototipik Pseudomonas aeruginosa'nın PAO1 in yeni alginat regülatörleri belirlemek.
Abstract
Pseudomonas aeruginosa yönlü metabolik yetenekleri olan bir Gram-negatif, çevresel bir bakteridir. P. aeruginosa kistik fibrozis (KF) hastalarda, kronik akciğer enfeksiyonları kuran bir fırsatçı bakteriyel patojendir. Ayrıca Mukus olarak bilinen alginat adlandırılan bir kapsüler polisakarit, bir aşırı antibiyotik kemoterapi ve bir ev sahibi savunma için planktonik hücrelerden daha fazla dirençli olan mukoid biyofilm oluşumunu teşvik eder. Buna ek olarak, sümüksü fenotipine nonmucoid gelen dönüşüm CF kronik enfeksiyonun başlaması için klinik bir belirteçtir. P. Alginate aşırı aeruginosa ağır hücresel enerji vergileri bir endergonic süreçtir. Bu nedenle, aljinat üretimi son derece P. düzenlenir aeruginosa. Alginat düzenleme daha iyi anlamak için, yeni bir aljinat regülatörü tanımlanması için mini-himar1 transposon mutagenez kullanılarak bir protokol açıklarbir prototipi gerginlik PAO1 s. Prosedürü iki temel aşamadan oluşmaktadır. İlk olarak, konakçı E. mini himar1 transpozonunda (pFAC) transfer alıcı P. içine coli SM10/λpir gentamisin ile takviye edilmiş Pseudomonas izolasyon agar levhaları üzerinde seçilmiştir, yüksek yoğunluklu bir ekleme mutant kütüphanesi oluşturmak için biparental konjügasyon yoluyla aeruginosa PAO1. İkincisi, biz ekranlı ve gentamisin kaset ve DNA dizilimi dışa dönük DNA primerleri kullanılarak ters PCR yoluyla ekleme sitesi haritasına mukoid koloniler izole. Bu protokolü kullanarak, (22 σ AlgT,) bir vahşi tip muca ana aljinat regülatör Algü için anti-sigma faktörü muca kodlayan ile gerginlik PAO1 iki roman aljinat regülatörleri, muce (PA4033) ve kinB (PA5484) belirledik . Bu, yüksek verimli mutajenez protokolü Colo değişime neden olan diğer hastalık oluşturma ilişkili genlerin tanımlanması için değiştirilebilirny morfolojisi.
Introduction
Alginat fazla üretmek için fırsatçı, Gram-negatif patojen Pseudomonas aeruginosa yeteneği bir biyofilm kurma yeteneğinde önemli bir faktördür. Alginatm aşırı üretimi genellikle Mukus adlandırılan bir fenotip. Kistik fibroz (CF) ile tutulmuş bireylerin balgam numune sümüksü koloni izolasyonu kronik enfeksiyonun göstergesidir ve doğrudan hastanın sağlığına 1 'de genel bir azalma ile ilişkilidir. Şu anda, bu anlaşılmaktadır P. aljinat düzenleme ve üretimi aeruginosa öncelikle iki operonlar oluşur. Arasında aljinat polimerin sentezi ve ihracat sorumludur (Alga – alg8 – alg44 – algK – alge – algG – algX – algL – Algı – algJ – – algF algD) ilk 12 genleri içeren aljinat bio-sentetik operonu, bir hücre dışı environme için periplazmant 2-5. İkinci operonu alternatif sigma faktörü Algü / T ile başlayan ve Muca, mucB ve mucD devam genlerin bir kümesidir. MucAB-D aljinat üretimi 6-8 negatif düzenleyicileri olarak sınıflandırılır ise Algü / T, pozitif bir düzenleyicisidir. Buna ek olarak, bu tür transkripsiyonel AlgB, AlgQ, Algr ve rpoN olarak düzenleyiciler, yanı sıra, transkripsiyon sonrası katabolik baskı ve kontrol, kinaz aktivitesi (KinB) ve zar içi proteoliz ile post-translasyonel değişikliği, aynı zamanda alginat dahil olmak gösterilmiştir düzenleme 9-14.
PFAC olarak bilinen mini himar1 transpozonunun vektör aslında Harvard Tıp Fakültesi'nde 15 Dr Mekalanos 'laboratuarda yaratılmış. PFAC plasmidi, iki 27 baz arasında ters çevrilmiş tekrarlar ve ortasında bir gentamisin direnç kaseti (aacC1: 534 bp) ile çevrili bir transpoze edilebilir elemanın oluşur hyperact kodlayan bir genmariner transposaz 16 ve bir gen kodlayan β-laktamaz (bla) (Şekil 1) ive. DQ366300 13: pFAC ve transpoze edilebilir eleman için sekans bilgileri, GenBank erişim numarası mevcuttur. PFAC olarak, ters PCR kullanılarak kromozomal sokma yerinin tanımlanması için kullanılan aacC1 geni arkasındaki bir çoklu klonlama bölgesinin (MCS) bulunmaktadır. Mini himar1 transpozonunda kullanarak önemli bir avantajı belirli bir konak faktörleri aktarılması (mutagenez) için gerekli olmasıdır. Ayrıca, P. genom genelinde bulunan TA dinükleotid ekleme siteleri yüksek bolluk var aeruginosa. Sırasıyla, genomları, örneğin, TA dinükleotid ekleme siteleri PAO1 yılında 94.404 ve 100.229 kez oluşur (6264404 bps, GenBank erişim numarası NC_002516.2) ve PA14 (GenBank erişim numarası NC_008463 6537648 bps). Çünkü genom, mini himar1 TA dinükleotidin bolluğu </em> Transpozon hastalık oluşturma genlerin analizi ve son derece düzenlenir genleri için özellikle uygun olan yüksek yoğunluklu ve rasgele mutagenezi, neden olabilir. Teorik olarak, mini-transpozon himar1 P. genomu içinde herhangi bir gerekli olmayan gen içine entegre olabilir aeruginosa. Bu, PAO1 genomuna açık okuma çerçevesinin başına yaklaşık 18 TA ekleme bölgelerini içerir.
Burada, P. Mukus sahip yeni regülatörleri belirlemek için bir mini transpozon himar1 dolayımlı mutagenez kullanılarak bir protokol açıklar aeruginosa. Daha özel olarak, E. biparentally bir mini transpozon içeren himar1 pFAC vektör konjüge nonmucoid prototrofik suşu PAO1 içine coli SM10/λpir. Transpozon genomuna entegre sonra, alıcı suşu Pseudomonas izolasyon agar E büyümesini inhibe eder (PIA) triklosan ihtiva eden kültürlenir coli. Dolayısı ile de, mutantlarının bir kütüphane <em> P. aeruginosa gentamisin ve mukoid fenotip varlığı ile takviye PIA plakası üzerindeki büyüme ile seçilebilir. Gerçek bir transpozon aracılı entegrasyon mutantın genel bir gentamisin dirençli ve karbenisilin duyarlı fenotipe sahip olacaktır, dikkat edin. Bu çalışmada, PAO1 yaklaşık 80,000 sokma mutantlan dört ayrı çekimleri ile izole edilmiştir. Daha sonra sümüksü izolatları için tarandı ve kısıtlayıcı enzim sindirimi, ligasyon ve ters PCR ile ek bölgesine tespit edilmiştir. Bu genom başına ekleme sayısının görmek için bir prob olarak gentamisin direnç kasedi kullanılarak Southern blot analizi yapıldı. Bu protokol kullanılarak konjugasyon başına elde mutantlarının fazla% 90 genomunda himar1 sadece tek bir kopyasına sahip ve gentamisin dirençli ve karbenisilin duyarlı fenotip gösterdiği tespit edilmiştir. 32 sümüksü izolat toplam tespit edilmiştir, bunlardan 22 P. farklı loci eşleştirilmiş aeruginosa PAO1kromozom. Yerleştirme Bu oran aljinat aşırı birkaç yeni regülatörleri tanımlamak için yeterli kapsama alanı sağlar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu yöntem, bu değişiklikler ile başka Pseudomonas türleri de kullanılabileceğini belirtmek önemlidir: K. inkübe fluorescens ve P. 30 ° C'de putida ve P. 42 ° C 'de stutzeri, P. stutzeri gentamisin 150 ug / mL 'si ile takviye edilmiş LB levhaları üzerinde kültür olmalıdır; adım 1.11, P. stutzeri hücreler LB 500 ul yerine 1 ml transfer edilmelidir. Ayrıca, bu protokol için iki kritik adımlar vardır. İlk olarak, al?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma, Biyomedikal Araştırma Mükemmellik Batı Virginia IDeA Ağı Ulusal Havacılık ve Uzay Dairesi Batı Virginia Uzay Grant Konsorsiyumu (NASA WVSGC), Kistik Fibrozis Vakfı (CFF-YU11G0) ve NIH P20RR016477 ve P20GM103434 tarafından desteklenmiştir. Biz bu çalışma ile teknik yardım için Vonya M. Eisinger teşekkür ederim.
Materials
| Luria Broth | Difco | 240230 | via Fisher Scientific |
| Pseudomonas isolation agar | Difco | 292710 | via Fisher Scientific |
| Small Plates (100 O.D. x 10 mm) | Fisher Scientific | 08-757-13 | |
| Large Plates (150 O.D. x 15 mm) | Fisher Scientific | 08-757-14 | |
| Glycerol | Fisher Scientific | BP229-4 | |
| Benchtop Shaking Incubator | New Brunswick Scientific | Innova 4080 | shake at 200 rpm |
| Cabinet Incubator | VWR | 1540 | |
| Benchtop Microcentrifuge | Sorvall | 75-003-287 | via Fisher Scientific |
| SmartSpec Plus Spectrophotometer | Bio-Rad | 170-2525 | or preferred method/vendor |
| Diposable Inoculation Loops | Fisher Scientific | 22-363-597 | |
| 1.5 mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
| 15 mL Tubes | Fisher Scientific | 05-539-12 | |
| Skim Milk | Difco | DF0032-17-3 | via Fisher Scientific |
| DNeasy Blood and Tissue (250) | Qiagen | 69506 | or preferred method/vendor |
| QIAquick PCR Purification Kit (250) | Qiagen | 28106 | or preferred method/vendor |
| QIAprep Spin Miniprep Kit (250) | Qiagen | 27106 | or preferred method/vendor |
| FastLink II DNA Ligation Kit | Epicentre Technologies | LK6201H | via Fisher Scientific |
| Accu block Digital Dry Bath | Labnet | NC0205808 | via Fisher Scientific |
| Sal1, restriction endonuclease | New England BioLabs | R0138L | |
| EasyStart Micro 50 | Molecular BioProducts | 6020 | via Fisher Scientific |
| Taq DNA Polymerase | New England BioLabs | M0267L | |
| iCycler, Thermocycler | Bio-Rad | 170-8740 | |
| LE agarose | Genemate | 3120-500 | via Fisher Scientific |
| Gentamycin Sulfate | Fisher Scientific | BP918-1 | |
| 2.0 mL Cryogenic Vials | Corning | 430659 | via Fisher Scientific |
Referências
- Govan, J. R., Deretic, V. Microbial pathogenesis in cystic fibrosis: mucoid Pseudomonas aeruginosa and Burkholderia cepacia. Microbiol. Rev. 60, 539-574 (1996).
- Chitnis, C. E., Ohman, D. E. Genetic analysis of the alginate biosynthetic gene cluster of Pseudomonas aeruginosa shows evidence of an operonic structure. Mol. Microbiol. 8, 583-593 (1993).
- Franklin, M. J., et al. Pseudomonas aeruginosa AlgG is a polymer level alginate C5-mannuronan epimerase. J. Bacteriol. 176, 1821-1830 (1994).
- Franklin, M. J., Ohman, D. E. Mutant analysis and cellular localization of the AlgI, AlgJ, and AlgF proteins required for O acetylation of alginate in Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 184, 3000-3007 (2002).
- Deretic, V., Gill, J. F., Chakrabarty, A. M. Gene algD coding for GDPmannose dehydrogenase is transcriptionally activated in mucoid Pseudomonas aeruginosa. J. Bacteriol. 169, 351-358 (1987).
- Mathee, K., McPherson, C. J., Ohman, D. E. Posttranslational control of the algT (algU)-encoded sigma22 for expression of the alginate regulon in Pseudomonas aeruginosa and localization of its antagonist proteins MucA and MucB (AlgN).. J. Bacteriol. 179, 3711-3720 (1997).
- Boucher, J. C., Schurr, M. J., Yu, H., Rowen, D. W., Deretic, V. Pseudomonas aeruginosa in cystic fibrosis: role of mucC in the regulation of alginate production and stress sensitivity. Microbiology. 143, 3473-3480 (1997).
- Martin, D. W., Holloway, B. W., Deretic, V. Characterization of a locus determining the mucoid status of Pseudomonas aeruginosa: AlgU shows sequence similarities with a Bacillus sigma factor. J. Bacteriol. 175, 1153-1164 (1993).
- Damron, F. H., Goldberg, J. B. Proteolytic regulation of alginate overproduction in Pseudomonas aeruginosa. Mol. Microbiol. 84 (4), 595-607 (2012).
- Browne, P., Barret, M., O’Gara, F., Morrissey, J. P. Computational prediction of the Crc regulon identifies genus-wide and species-specific targets of catabolite repression control in Pseudomonas bacteria. BMC Microbiol. 10, 300 (2010).
- Damron, F. H., Qiu, D., Yu, H. D. The Pseudomonas aeruginosa sensor kinase KinB negatively controls alginate production through AlgW-dependent MucA proteolysis. J. Bacteriol. 191, 2285-2295 (2009).
- Damron, F. H., et al. Analysis of the Pseudomonas aeruginosa regulon controlled by the sensor kinase KinB and sigma factor RpoN. J. Bacteriol. 194, 1317-1330 (2012).
- Qiu, D., Eisinger, V. M., Rowen, D. W., Yu, H. D. Regulated proteolysis controls mucoid conversion in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 104, 8107-8112 (2007).
- Schurr, M. J. Which bacterial biofilm exopolysaccharide is preferred, Psl or alginate. J. Bacteriol. 195, 1623-1626 (2013).
- Wong, S. M., Mekalanos, J. J. Genetic footprinting with mariner-based transposition in Pseudomonas aeruginosa. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97, 10191-10196 (2000).
- Lampe, D. J., Akerley, B. J., Rubin, E. J., Mekalanos, J. J., Robertson, H. M. Hyperactive transposase mutants of the Himar1 mariner transposon. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 11428-11433 (1999).
