Оценка сосудистой регенерации в ЦНС Использование мыши Retina
Summary
Сетчатка грызун уже давно признана в качестве доступного окна в мозг. В этом техническом документе мы предоставляем протокол, который использует модель мыши кислорода, вызванной ретинопатии для изучения механизмов, которые приводят к выходу из строя сосудистой регенерации в центральной нервной системе после ишемического повреждения. Описанная система также может быть использована для изучения стратегий для продвижения отрастания функциональных кровеносных сосудов в сетчатке и ЦНС.
Abstract
Сетчатка грызунов, пожалуй, самый доступный система млекопитающих, в которой для расследования сосудисто-нервный взаимодействие в центральной нервной системе (ЦНС). Он все чаще признается, что несколько нейродегенеративных заболеваний, таких как болезнь Альцгеймера, рассеянный склероз и боковой амиотрофический склероз, присутствующих элементов сосудистой компромисса. Кроме того, самые выдающиеся причины слепоты в педиатрических и работающего населения возрастных (ретинопатии недоношенных и диабетической ретинопатии, соответственно) характеризуются сосудистой дегенерации и разрушения физиологической сосудистой отрастания. Целью данного технического документа заключается в предоставлении подробный протокол для изучения ЦНС регенерацию сосудов в сетчатке. Метод может быть использован для выяснения молекулярные механизмы, которые приводят к выходу из строя роста сосудов после ишемического повреждения. Кроме того, потенциальные терапевтические методы для ускорения и восстановления здоровых сосудистых сплетений могут быть изучены. Выводы obtaineг, используя описанный подход может обеспечить терапевтические возможности для ишемических ретинопатии, такие как, что диабета или недоношенных и, возможно, выиграют других сосудистых расстройств ЦНС.
Introduction
На протяжении развития ЦНС, нервов, иммунных клеток и кровеносных сосудов создать удивительно сочетании сетей для обеспечения адекватной перфузии тканей и позволяют передачу сенсорной информации 1-5. Разбивка сосудистых систем приводит к недостаточной оксигенации тканей и скомпрометированной питания метаболического и получает все большее признание в качестве важного вклад в патогенезе нейродегенеративных заболеваний 6. Сосудистая отсева и ухудшение сосудисто-нервного блока в мозге, например, связана с сосудистой деменцией, сосудистых поражений белого вещества головного мозга 7 и болезни Альцгеймера со стенозом артериол и мелких сосудов 8. Кроме того, нарушение сосудистой функции барьера, как полагают, способствуют рассеянный склероз 9 и боковой амиотрофический склероз 10.
Непосредственное значение для сетчатки модели, описанной в данном протоколе, ослепляязаболеваний, таких как диабетическая ретинопатия и 11 ретинопатии недоношенных 12, 13, характеризуются фазе ранней сосудистой дегенерации. Последовавшая за этим ишемическая нагрузка на сосудисто-нервного сетчатки вызывает второй этап чрезмерной и патологической неоваскуляризации, что скорее всего возникает как компенсаторная реакция вновь установить кислорода и энергоснабжение 14-16. Привлекательная стратегия для преодоления ишемический стресс, который занимает центральное место в прогрессирования заболевания является восстановление функциональных сосудистых сетей в частности, в ишемических зон нейро-сетчатки (рис. 2 и 3). Провоцирование контролируемую ангиогенную ответ может встретить, как нелогичным для состояния, в котором антиангиогенные лечения, такие как анти-VEGFs рассматриваются как адаптированных процедур. Тем не менее, доказательства справедливости этого подхода является монтаж. Например, повышение "физиолого-как" сосудистый отрастания в ischemIC ретинопатии было элегантно продемонстрирована путем введения эндотелиальных клеток-предшественников 17, ингибирование Müller клеток выражали VEGF, индуцированного подавлением других ангиогенных факторов 18, инъекции миелоидных предшественников, 19 ингибированию NADPH-оксидазы индуцированного апоптоза 20, увеличение диетического ω-3 полиненасыщенных жирных кислоты потребление 21, лечение с карбоксильной-концевого фрагмента триптофана тРНК синтетазы 22 и непосредственным управлением VEGF или FGF-2 для защиты глиальных клеток 23. Более того, мы показали, что модуляции классические нейронные сигналы наведения, такие как Semaphorins или Netrins в ишемических ретинопатии ускоряет сосудистую регенерацию здоровых сосудов в сетчатке и, следовательно, снижает патологическое развитие кровеносных сосудов 24, 25. Непосредственное клиническое значение, некоторые из вышеупомянутых исследованиях на животных свидетельствуют, что содействие сосудистой репоколение во время ранней стадии ишемической ретинопатии может значительно уменьшить смотровое угрожающих предварительно неоваскуляризации сетчатки 19, 23, 24, 26, скорее всего, за счет сокращения ишемической нагрузки.
Разработка терапевтических стратегий, которые стимулируют регенерацию функциональных сосудов остается сложной задачей для сосудистых биологов. Здесь мы опишем экспериментальную систему, которая использует модель мыши кислорода, вызванной ретинопатии (OIR) для изучения стратегий для модуляции сосудистой отрастания в сетчатке. Разработано Смит и др.. В 1994 27, эта модель служит в качестве прокси для пролиферативные ретинопатии человека и состоит из не подвергая щенков P7 мыши до 75% О 2 до Р12, а затем повторного введения щенков до комнатной температуры окружающей O 2-напряжение (рис. 1). Эта парадигма свободно имитирует сценарий, где недоношенный ребенок вентилируетсяс O 2. Разоблачение щенков мыши гипероксии провоцирует дегенерацию сетчатки капилляров и микрососудов, и дает воспроизводимый площадь вазо-облитерации (VO), как правило, начисленных на выходе из O 2 на P12, хотя максимальная площадь В.О. достигается через 48 часов (P9) после воздействие O 2 28. У мышей, ВО зоны бессосудистые спонтанно регенерировать в течение недели, следующей повторного введения в комнатном воздухе и в конечном итоге В.О. зоны полностью заново васкуляризации (рис. 2). Повторное введение в комнатном воздухе мышей, подвергнутых OIR также провоцирует предварительно неоваскуляризации сетчатки (NV) (максимальное в P17), что, как правило, оцениваться с точки зрения эффективности антиангиогенных парадигм лечения. В чистом виде, модель OIR обеспечивает высокую воспроизводимость и количественному инструмент для оценки сосудистой дегенерации кислорода, вызванной и определить степень разрушительного предварительно неоваскуляризации сетчатки 29-31.
<p claсс = "jove_content"> Различные обзорных парадигмы лечения, которые модулируют ЦНС регенерации сосудов могут быть исследованы с помощью OIR модели, включающей использование фармакологических соединений, генной терапии, делеции гена и многое другое. Склонность данного подхода влиять сосудистой отрастания оценивается поэтапный в окне между P12 (максимальная В.О. после выхода из гипероксии) и Р17 (максимальная NV). Оценка результатов лечения патологического по NV может быть быстро и легко определены параллельно и было подробно описано по Stahl и его коллеги 30, 31. Здесь мы предлагаем простой шаг за шагом процедуры для расследования модуляцию физиологической реваскуляризации в нервной сетчатки фармакологическими соединений, перспективных терапевтических, вирусных векторов или для изучения влияния генов-кандидатов в трансгенных или мышей с.Protocol
Representative Results
Discussion
Что является наиболее эффективным способом, чтобы стимулировать рост новых здоровых сосудов ишемической нервной ткани? Это терапевтически действует вмешиваться и ускорять естественные сосудистой отрастания? В нейро-ишемическая патологий, таких как ишемических ретинопатии или инсу?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PS держит Стул Исследования Канады в сетчатке глаза клеточной биологии и Alcon научно-исследовательский институт новому следователю Award. Эта работа была поддержана грантами от Канадского института исследований в области здравоохранения (221478), Канадская ассоциация диабета (ОГ-3-11-3329-PS), естественных наук и инженерным исследованиям Совета Канады (418637) и Фонд Борьба Слепота Канада. Была также оказана поддержка по RESEAU по исследованиям ан Санте де-ла-видения Квебека.
Materials
| C57Bl/6 mice ((Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other) | |||
| CD1 nursing mothers | Vendor of choice | ||
| Operating Scissors straight | World Precision Instruments | 14192 | |
| Dissecting Scissors straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Vannas Eye Scissors | Harvard Apparatus | 72-8483 | |
| Iris Forceps, curved, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Brushes 362R size 0 | Dynasty | ||
| Dumont Forceps #3; straight | World Precision Instruments | 500338 | |
| Surgical Blade, size 10 | Bard-Parker | 371110 | |
| Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories, Inc | RL-1102 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| Fluoromount G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope | Zeiss | ||
| Leica MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | ||
| Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 | Sigma-Aldrich | 46945 |
Referências
- Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
- Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
- Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
- Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
- Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
- Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
- Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
- Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
- Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
- Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
- Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
- Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
- Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
- Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
- Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
- Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
- Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
- Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
- Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
- Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
- Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
- Joyal, J. -. S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
- Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
- Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
- Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
- Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
- Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
- Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
- Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
- Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
- Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
- Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
- Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
- Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
- Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
