マウス網膜を使用してCNSにおける血管再生の評価
Summary
げっ歯類の網膜は、長い脳へのアクセス可能なウィンドウとして認識されている。この技術的な論文では、虚血性損傷後の中枢神経系内の血管再生の故障につながるメカニズムを研究するために、酸素誘発性網膜症のマウスモデルを採用しているプロトコルを提供する。説明したシステムはまた、網膜およびCNS内の機能の血管の成長を促進するための戦略を探求するために利用することができる。
Abstract
げっ歯類の網膜は、おそらく中枢神経系（CNS）内の神経血管の相互作用を調査するためにここで最もアクセスしやすい哺乳動物系である。これは、ますます認識されているように、アルツハイマー病、多発性硬化症、および血管妥協の筋萎縮性側索硬化症などのいくつかの要素が存在する神経変性疾患。また、小児および労働年齢人口（未熟児及び糖尿病性網膜症の網膜症、それぞれ）の失明の最も顕著な原因は、生理的な血管の再成長の血管変性や障害によって特徴づけられる。この技術的論文の目的は、網膜におけるCNSの血管再生を研究するための詳細なプロトコルを提供することです。この方法は、虚血性損傷後の血管増殖の故障につながる分子メカニズムを解明するために用いることができる。また、健康的な血管叢を加速し、回復させる可能性のある治療法を検討することができます。調査結果はobtainedは記載されたアプローチを使用して、糖尿病又は未熟児網膜症と虚血の治療手段を提供し、場合によってはCNSの他の血管障害の利益を得ることができる。
Introduction
CNSの発達、神経、免疫細胞および血管を通して適切な組織灌流を確認し、感覚情報1-5の伝送を可能にするために顕著に結合されたネットワークを確立する。不十分な組織の酸素と妥協代謝供給や血管のシステムの結果の内訳は、ますます神経変性疾患6の病因に重要な貢献者として認識されている。血管ドロップアウトし、脳内の神経血管装置の劣化は、例えば、血管性認知症、脳7の白質の血管病変や動脈および小血管8の狭窄症、アルツハイマー病と関連している。さらに、障害、血管バリア機能9は、多発性硬化症および筋萎縮性側索硬化症10寄与すると考えられる。
まばゆいばかりの、このプロトコルで説明網膜モデルに直接関係の糖尿病性網膜症、未熟児11と12の網膜症などの疾患は、13早期血管変性の位相によって特徴付けられる。神経血管網膜上のその後の虚血性ストレスは、おそらく再、元に戻すの酸素とエネルギー供給14〜16への代償性反応として開始過度および病理学的血管新生の第二段階をトリガします。疾患の進行の中心となる虚血性ストレスを克服するための魅力的な戦略は、特異的に神経網膜（ 図2および図3）の虚血区域に官能血管網を復元することである。制御血管新生反応を誘発することは直感に反するような抗VEGF類のような抗血管新生療法が適応の治療として考慮される条件として出くわすことがあります。しかし、このアプローチの有効性の証拠は、搭載されている。 ischemの例では、「生理的のような「増強する血管の成長ICの網膜症は、エレガントな内皮前駆細胞17、食事、ω-3多価不飽和脂肪酸の増加、他の血管新生因子18、骨髄前駆細胞19の注入、NADPHオキシダーゼ誘導されるアポトーシス20の阻害のミュラー細胞に発現VEGF誘発性ダウンレギュレーションの阻害の導入により実証されている酸摂取21、トリプトファンtRNA合成22のカルボキシル末端断片、およびグリア細胞23の保護のために、VEGFまたはFGF-2の直接投与による治療。また、我々は、虚血性網膜症でそのようなセマフォリンまたはネトリンなどの古典的な神経ガイダンスキューを調節する網膜内の健康な血管の血管再生を加速し、その結果、病的血管新生24,25を低減することを実証した。直接的な臨床的関連性のため、前述の動物実験のいくつかは、血管の再を促進するという証拠を提供する網膜症の初期の虚血性段階の間に発生が大幅に可能性虚血性負荷の低減を通じて、視力を脅かす前網膜新生血管19、23、24、26を減らすことができます。
機能的な血管の再生を刺激治療戦略を考案することは、血管生物学者のための重要な課題である。ここでは、網膜内の血管の再成長を調節する方策を探求するために、酸素誘発性網膜症（OIR）のマウスモデルを用いた実験系を記述する。 Smith らによって開発された。1994年27で、このモデルは、人間の増殖性網膜症のためのプロキシとして機能し、P12まで75％のO 2にP7の仔マウスを暴露し、その後、周囲の部屋のO 2 -緊張します（ 図に子犬を再導入することからなる1）。このパラダイムは緩く未熟児が換気されているシナリオを模倣O 2で。高濃度酸素への仔マウスの露出は、網膜毛細血管や微小血管の変性を誘発し、最大VO領域は48時間後（P9）に達しているが、血管閉塞（VO）の再現性のある区域は、一般的に、P12でのO 2の終了時に評価し得O 2 28への暴露。マウスでは、無血管のVOゾーンは自然に室内空気への再導入、最終的には、VOゾーンは完全に再血管化された（ 図2）は、次の週に渡って再生成します。 OIRを受けたマウスの室内空気への再導入は、典型的には、抗血管新生治療パラダイムの有効性を判断するために評価される前網膜血管新生（NV）（P17で最大）を引き起こす。その純粋な形では、OIRモデルは、酸素によって誘導される血管変性を評価し、破壊的な前網膜新生血管29〜31の範囲を決定するために、高度に再現性があり、定量化可能なツールを提供しています。
<p classは= "jove_content"> CNS血管再生を調節する種々の探索的治療パラダイムは、薬理学的化合物の使用、遺伝子治療、遺伝子欠失などを含むOIRモデルを用いて調べることができる。血管の再成長に影響を与える特定のアプローチの傾向は、P12（高酸素を終了後に最大VO）およびp17（最大ネバダ州）間のウィンドウ内で段階的に評価する。病理学上のNV治療結果の評価は、迅速かつ容易に並行して決定することができ、十分にスタールら30、31により記載されている。ここでは、薬理学的化合物、将来の治療薬、ウイルスベクターによって神経網膜内の生理的血行再建術の変調を調査するか、トランスジェニックやノックアウトマウスでの候補遺伝子の影響を研究するために、簡単なステップバイステップの手順を提供する。Protocol
Representative Results
Discussion
虚血性神経組織内に新しい健全な血管の成長を刺激するための最も効果的な方法は何ですか？それが干渉し、血管再生を天然加速させる治療的に有効である？虚血性網膜症や脳卒中などの神経の虚血性の病変では、血管の変性が低下し、神経機能35-38に関連している。したがって、疾患の初期/即時セグメントの間に、地域微小循環を回復、早期の傷害に対抗することは有益性を実証?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PSは、網膜細胞生物学のカナダの研究の椅子とアルコン研究所新研究者賞を取得しています。この作品は、カナダ衛生研究所（221478）からの補助金によって支えられて、カナダ糖尿病協会（OG -3 – 11から3329-PS）、自然科学とカナダの工学研究会（418637）及び財団ファイティング失明カナダ。サポートも網状のもの·デ·ルシェルシュエンサンテ·デ·ラ·ビジョン·デュ·ケベックから提供された。
Materials
| C57Bl/6 mice ((Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other) | |||
| CD1 nursing mothers | Vendor of choice | ||
| Operating Scissors straight | World Precision Instruments | 14192 | |
| Dissecting Scissors straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Vannas Eye Scissors | Harvard Apparatus | 72-8483 | |
| Iris Forceps, curved, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
| Brushes 362R size 0 | Dynasty | ||
| Dumont Forceps #3; straight | World Precision Instruments | 500338 | |
| Surgical Blade, size 10 | Bard-Parker | 371110 | |
| Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories, Inc | RL-1102 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
| Fluoromount G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
| Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope | Zeiss | ||
| Leica MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | ||
| Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 | Sigma-Aldrich | 46945 |
Referências
- Carmeliet, P., Tessier-Lavigne, M. Common mechanisms of nerve and blood vessel wiring. Nature. 436, 193-200 (2005).
- Eichmann, A., Thomas, J. L. Molecular Parallels between Neural and Vascular Development. Cold Spring Harb Perspect Med. 3, (2012).
- Larrivee, B., Freitas, C., Suchting, S., Brunet, I., Eichmann, A. Guidance of vascular development: lessons from the nervous system. Circ Res. 104, 428-441 (2009).
- Stefater Iii, J. A., et al. Regulation of angiogenesis by a non-canonical Wnt-Flt1 pathway in myeloid cells. Nature. 474, 511-515 (2011).
- Checchin, D., Sennlaub, F., Levavasseur, E., Leduc, M., Chemtob, S. Potential role of microglia in retinal blood vessel formation. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3595-3602 (2006).
- Quaegebeur, A., Lange, C., Carmeliet, P. The neurovascular link in health and disease: molecular mechanisms and therapeutic implications. Neuron. 71, 406-424 (2011).
- Yamamoto, Y., Craggs, L., Baumann, M., Kalimo, H., Kalaria, R. N. Review: molecular genetics and pathology of hereditary small vessel diseases of the brain. Neuropathol Appl Neurobiol. 37, 94-113 (2011).
- Brun, A., Englund, E. A white matter disorder in dementia of the Alzheimer type: a pathoanatomical study. Ann Neurol. 19, 253-262 (1986).
- Prat, A., et al. Migration of multiple sclerosis lymphocytes through brain endothelium. Arch Neurol. 59, 391-397 (2002).
- Rule, R. R., Schuff, N., Miller, R. G., Weiner, M. W. Gray matter perfusion correlates with disease severity in ALS. Neurology. 74, 821-827 (2010).
- Antonetti, D. A., Klein, R., Gardner, T. W. Diabetic retinopathy. N Engl J Med. 366, 1227-1239 (2012).
- Hartnett, M. E., Penn, J. S. Mechanisms and management of retinopathy of prematurity. N Engl J Med. 367, 2515-2526 (2012).
- Sapieha, P., et al. Retinopathy of prematurity: understanding ischemic retinal vasculopathies at an extreme of life. J Clin Invest. 120, 3022-3032 (2010).
- Chen, J., Smith, L. Retinopathy of prematurity. Angiogenesis. 10, 133-140 (2007).
- Cheung, N. Diabetic retinopathy and systemic vascular complications. Progress in Retinal and Eye Research. 27, 161-176 (2008).
- Smith, L. E. Through the eyes of a child: understanding retinopathy through ROP the Friedenwald lecture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 5177-5182 (2008).
- Caballero, S., et al. Ischemic vascular damage can be repaired by healthy, but not diabetic, endothelial progenitor cells. Diabetes. 56, 960-967 (2007).
- Wang, H., et al. VEGF-mediated STAT3 activation inhibits retinal vascularization by down-regulating local erythropoietin expression. Am J Pathol. 180, 1243-1253 (2012).
- Ritter, M. R., et al. Myeloid progenitors differentiate into microglia and promote vascular repair in a model of ischemic retinopathy. J Clin Invest. 116, 3266-3276 (2006).
- Saito, Y., Geisen, P., Uppal, A., Hartnett, M. E. Inhibition of NAD(P)H oxidase reduces apoptosis and avascular retina in an animal model of retinopathy of prematurity. Mol Vis. 13, 840-853 (2007).
- Connor, K. M., et al. Increased dietary intake of omega-3-polyunsaturated fatty acids reduces pathological retinal angiogenesis. Nat Med. 13, 868-873 (2007).
- Banin, E., et al. T2-TrpRS inhibits preretinal neovascularization and enhances physiological vascular regrowth in OIR as assessed by a new method of quantification. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 2125-2134 (2006).
- Dorrell, M. I., et al. Maintaining retinal astrocytes normalizes revascularization and prevents vascular pathology associated with oxygen-induced retinopathy. Glia. 58, 43-54 (2010).
- Joyal, J. -. S., et al. Ischemic neurons prevent vascular regeneration of neural tissue by secreting semaphorin 3A. Blood. 117, 6024-6035 (2011).
- Binet, F., et al. Neuronal ER Stress Impedes Myeloid-Cell-Induced Vascular Regeneration through IRE1alpha Degradation of Netrin-1. Cell Metab. 17, 353-371 (2013).
- Fukushima, Y., et al. Sema3E-PlexinD1 signaling selectively suppresses disoriented angiogenesis in ischemic retinopathy in mice. J Clin Invest. 121, 1974-1985 (2011).
- Smith, L. E., et al. Oxygen-induced retinopathy in the mouse. Invest Ophthalmol Vis Sci. 35, 101-111 (1994).
- Lange, C., et al. Kinetics of retinal vaso-obliteration and neovascularisation in the oxygen-induced retinopathy (OIR) mouse model. Graefes Arch Clin Exp Ophthalmol. 247, 1205-1211 (2009).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
- Stahl, A., et al. The mouse retina as an angiogenesis model. Invest Ophthalmol Vis Sci. 51, 2813-2826 (2010).
- Stahl, A., et al. Computer-aided quantification of retinal neovascularization. Angiogenesis. 12, 297-301 (2009).
- Stahl, A., et al. Postnatal Weight Gain Modifies Severity and Functional Outcome of Oxygen-Induced Proliferative Retinopathy. Am J Pathol. 177, 2715-2723 (2010).
- Cerani, A., et al. Neuron-Derived Semaphorin 3A is an Early Inducer of Vascular Permeability in Diabetic Retinopathy via Neuropilin-1. Cell Metabolism. 18, 505-518 (2013).
- Sapieha, P. Eyeing central neurons in vascular growth and reparative angiogenesis. Blood. 120, 2182-2194 (2012).
- Dorfman, A., Dembinska, O., Chemtob, S., Lachapelle, P. Early manifestations of postnatal hyperoxia on the retinal structure and function of the neonatal rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 49, 458-466 (2008).
- Dorfman, A. L., Joly, S., Hardy, P., Chemtob, S., Lachapelle, P. The effect of oxygen and light on the structure and function of the neonatal rat retina. Doc Ophthalmol. 118, 37-54 (2009).
- Chopp, M., Zhang, Z. G., Jiang, Q. Neurogenesis, angiogenesis, and MRI indices of functional recovery from stroke. Stroke. 38, 827-831 (2007).
- Li, L., et al. Angiogenesis and improved cerebral blood flow in the ischemic boundary area detected by MRI after administration of sildenafil to rats with embolic stroke. Brain Res. 1132, 185-192 (2007).
- Robinson, R., Barathi, V. A., Chaurasia, S. S., Wong, T. Y., Kern, T. S. Update on animal models of diabetic retinopathy: from molecular approaches to mice and higher mammals. Dis Model Mech. 5, 444-456 (2012).
- Chia, R., Achilli, F., Festing, M. F., Fisher, E. M. The origins and uses of mouse outbred stocks. Nat Genet. 37, 1181-1186 (2005).
- Jenuth, J. P., Peterson, A. C., Shoubridge, E. A. Tissue-specific selection for different mtDNA genotypes in heteroplasmic mice. Nat Genet. 16, 93-95 (1997).
- Mattapallil, M. J., et al. The Rd8 mutation of the Crb1 gene is present in vendor lines of C57BL/6N mice and embryonic stem cells, and confounds ocular induced mutant phenotypes. Investigative ophthalmolog., & visual science. 53, 2921-2927 (2012).
