Den gnager retina har lenge vært anerkjent som et tilgjengelig vinduet til hjernen. I dette tekniske papir gir vi en protokoll som anvender musemodell av oksygen-indusert retinopati for å studere de mekanismer som fører til svikt av vaskulær regenereringen innenfor sentralnervesystemet etter iskemisk skade. Den beskrevne systemet kan også bli brukt til å utforske strategier for å fremme gjenvekst av funksjonelle blodkar i netthinnen og CNS.
Den gnager retina er kanskje den mest tilgjengelige pattedyrsystem hvor undersøke neurovaskulær samspill i sentralnervesystemet (CNS). Det er i økende grad erkjent at flere neurodegenerative sykdommer så som Alzheimers, multippel sklerose og amyotrofisk lateral sklerose stede elementer av vaskulær kompromiss. I tillegg er de mest fremtredende årsakene til blindhet hos barn og yrkesaktiv alder populasjoner (retinopati hos premature og diabetisk retinopati, henholdsvis) preget av vaskulær degenerasjon og svikt i fysiologiske vaskulær gjenvekst. Målet med denne tekniske artikkelen er å gi en detaljert protokoll for å studere CNS vaskulær regenerering i netthinnen. Fremgangsmåten kan anvendes til å belyse molekylære mekanismer som fører til svikt i vaskulær vekst etter iskemisk skade. I tillegg, kan potensielle terapeutiske metoder for å akselerere og gjenopprette sunn vaskulære plexuses bli utforsket. Funn obtained hjelp av den beskrevne metode kan gi terapeutiske muligheter for iskemiske retinopatier, som det av diabetes eller for tidlig fødsel og eventuelt benytte andre vaskulære forstyrrelser i sentralnervesystemet.
Gjennom CNS utvikling, nerver, immunceller og blodårer etablere bemerkelsesverdig kombinert nettverk for å sikre tilstrekkelig vevsperfusjon og tillate overføring av sensorisk informasjon 1-5. Fordelingen av vaskulære systemer resulterer i utilstrekkelig vevsoksygenering og kompromittert metabolske tilbud og er i økende grad anerkjent som en viktig bidragsyter til patogenesen av nevrodegenerative sykdommer seks. Vaskulær frafall og forringelse av neurovascular enheten i hjernen, for eksempel, er assosiert med vaskulær demens, vaskulære lesjoner i den hvite substans i hjernen 7 og Alzheimers sykdom med stenose av arterioler og mindre fartøy 8. I tillegg er nedsatt vaskulær barrierefunksjon antatt å bidra multippel sklerose 9 og amyotrofisk lateral sklerose 10..
Av direkte relevans til retinal modellen beskrevet i denne protokollen, blindingsykdommer slik som diabetisk retinopati 11 og prematuritetsretinopati 12, 13 er kjennetegnet ved en tidlig fase av vaskulær degenerasjon. Den påfølgende iskemisk stress på neurovascular retina utløser en andre fase av overdreven og patologiske neovaskularisering som sannsynligvis stammer som kompensasjons respons på re-instate oksygen og energiforsyning 14-16. En attraktiv strategi for å overvinne den iskemiske stress som er sentralt for sykdomsutvikling, er å gjenopprette funksjonelle vaskulære nettverk spesifikt i de iskemiske soner av neuro-retina (figurene 2 og 3). Provoserte en kontrollert angiogent respons kan komme over som bakvendt for en tilstand der anti-angiogenic behandlinger som for eksempel anti-VEGFs anses som tilpasset behandling. Likevel, er bevis for gyldigheten av denne tilnærmingen montering. For eksempel styrke "fysiologisk-aktig" vaskulær gjenvekst i ischemic retinopathies har blitt elegant demonstrert gjennom innføring av endothelial forløper celler 17, hemming av Müller celle-uttrykt VEGF indusert nedregulering av andre angiogenetiske faktorer 18, injeksjon av myeloide stamceller 19, hemming av NADPH oksidase indusert apoptose 20, økende kosttilskudd ω-3 flerumettede fettsyrer syre inntak 21, behandling med et karboksyl-terminalt fragment av tryptofan tRNA syntetase 22, og direkte tilførsel av VEGF eller FGF-2 for beskyttelse av gliaceller 23. Videre har vi vist at moduler klassiske nevronale veiledning signaler som Semaphorins eller Netrins i iskemiske retinopathies akselererer vaskulær regenerering av sunne fartøy innenfor netthinnen og dermed reduserer patologisk angiogenese 24, 25. Av direkte klinisk relevans, flere av de nevnte dyrestudier gir bevis for at fremme vaskulær reutvikling under den tidlige fase av ischemisk retinopatier kan redusere synstruende pre-retinal neovaskularisering 19, 23, 24, 26, sannsynligvis ved å redusere iskemisk byrde.
Devising terapeutiske strategier som stimulerer regenerering av funksjonelle skip er fortsatt en betydelig utfordring for vaskulære biologer. Her beskriver vi en eksperimentell system som benytter mus modell av oksygen-indusert retinopati (OIR) for å utforske strategier for å modulere vaskulær gjenvekst i netthinnen. Utviklet av Smith et al. I 1994 27, fungerer denne modellen som en proxy for menneske proliferative retinopathies og består av å utsette P7 museunger til 75% O 2 til P12 og senere gjeninnføre valpene til omgivelses O 2-spenning (Figur 1). Dette paradigmet løst etterligner et scenario der et prematurt barn er ventilertmed O 2. Eksponeringen av museunger til hyperoksi provoserer degenerasjon av netthinnens blodkar og microvasculature, og gir en reproduserbar område av vaso-utslettelse (VO) vanligvis undersøkes ved avkjørsel fra O 2 ved P12, selv om maksimal VO området er nådd ved 48 hr (P9) etter eksponering for O 2 28. I mus, den avaskulære soner VO spontant regenereres i løpet av uken etter re-innføring i luften i rommet, og til slutt VO soner er fullstendig re-vascularized (figur 2). Re-introduksjon til romluften av mus utsatt for OIR provoserer også pre-retinal neovascularization (NV) (maksimalt på P17) som vanligvis vurderes for å fastslå effekten av anti-angiogenic behandling paradigmer. I sin reneste form, gir OIR modellen en svært reproduserbare og kvantifiserbare verktøy for å vurdere oksygen-indusert vaskulær degenerasjon og fastslå omfanget av destruktiv pre-retinal neovascularization 29-31.
<p class = "jove_content"> Ulike eksplorerende behandling paradigmer som modulerer CNS vaskulær regenerasjon kan undersøkes ved hjelp av OIR modell inkludert bruk av farmakologiske stoffer, genterapi, genet sletting og mer. Tilbøyelighet til en gitt tilnærming til å påvirke vaskulær gjenvekst vurderes trinnvis i vinduet mellom P12 (maksimal VO etter exit fra hyperoksi) og P17 (maksimal NV). Vurdering av resultatet behandling av patologiske NV kan hurtig og lett bestemmes i parallell og har blitt grundig beskrevet av Stahl og kolleger 30, 31. Her gir vi en enkel steg-for-trinn prosedyre for å undersøke modulering av fysiologiske revaskularisering innen nevrale netthinnen av farmakologiske stoffer, potensielle legemiddelselskap, virale vektorer eller for å studere betydningen av kandidatgener i genmodifiserte eller knockout mus.Hva er den mest effektive måten å stimulere veksten av nye friske fartøy i iskemisk nervevev? Er det terapeutisk gyldig å forstyrre og akselerere naturlig forekommende vaskulær gjenvekst? I nevro-iskemisk patologier som iskemiske retinopathies eller hjerneslag, er vaskulær degenerasjon assosiert med redusert nervecellefunksjon 35-38. Derav å motvirke tidlig skade, gjeninnføre regionalt mikrosirkulasjonen i umiddelbar / tidlig segment av sykdom kan være gunstig. I en okulær sammenheng, eksperimentell…
The authors have nothing to disclose.
PS har en Canada Research Chair i Netthinne Cell Biology og Alcon Research Institute New Investigator Award. Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra den kanadiske Institutes of Health Research (221478), den kanadiske Diabetes Association (OG-3-11-3329-PS), naturvitenskap og Engineering Research Council of Canada (418637) og Stiftelsen Fighting Blindness Canada. Støtte ble også gitt av Réseau de Recherche en Santé de la Vision du Québec.
C57Bl/6 mice ((Other strains may be used; angiogenic response varies from one strain to the other) | |||
CD1 nursing mothers | Vendor of choice | ||
Operating Scissors straight | World Precision Instruments | 14192 | |
Dissecting Scissors straight | World Precision Instruments | 14393 | |
Vannas Eye Scissors | Harvard Apparatus | 72-8483 | |
Iris Forceps, curved, serrated | World Precision Instruments | 15915 | |
Brushes 362R size 0 | Dynasty | ||
Dumont Forceps #3; straight | World Precision Instruments | 500338 | |
Surgical Blade, size 10 | Bard-Parker | 371110 | |
Rhodamine Griffonia (Bandeiraea) Simplicifolia Lectin I | Vector Laboratories, Inc | RL-1102 | |
Microscope slides | VWR | 16004-368 | |
Fluoromount G | Electron Microscopy Sciences | 17984-25 | |
Zeiss Axio Observer Z1 Inverted Phase and Fluorescence Microscope | Zeiss | ||
Leica MZ9.5 Stereomicroscope | Leica | ||
Fluorescein isothicyanate-dextran, 70000 | Sigma-Aldrich | 46945 |