فيفو السابقين الثقافة من الفأر الجنينية بالبشرة والتصوير لايف للهجرة أرومة ميلانينية
Summary
وصفنا تشريح الجسم الحي وخارج ثقافة الماوس الجلد الجنينية. يحافظ على نظام الثقافة واجهة الهواء السائل عبر سطح الأنسجة ويسمح التصوير على مجهر مقلوب. Melanoblasts، وهو مكون من الجلد النامية، fluorescently المسمى السماح سلوكهم الواجب مراعاتها باستخدام متحد البؤر المجهري.
Abstract
Melanoblasts هي قمة العصبية المشتقة من الخلايا الصباغية السلائف؛ الخلايا المسؤولة عن إنتاج الصباغ في الجلد والشعر. Melanoblasts تهاجر من خلال البشرة للجنين حيث استعمار في وقت لاحق من الشعر النامي بصيلات 1،2. ودرس قمة العصبية خلية الهجرة على نطاق واسع في المختبر ولكن في طرق الحي لا تزال غير متطورة، خاصة في أنظمة الثدييات. بديل واحد هو استخدام فيفو السابقين الثقافة عضوي النمط 3-6. ثقافة الماوس الجلد الجنينية يتطلب الحفاظ على واجهة الهواء السائل (علي) عبر السطح من 3،6 الأنسجة. وقد أعاق عالية الدقة الحية التصوير من الجلد الماوس الجنينية بسبب عدم وجود وسيلة جيدة أن يحافظ ليس هذا فقط ولكن يسمح ALI الثقافة لتكون معكوسة، وبالتالي متوافقة مع مسافة عمل قصيرة العدسات موضوعية والمجاهر معظم متحد البؤر أيضا. توضح هذه المقالة التحسينات الأخيرة لميثالتطوير التنظيمي الذي يستخدم غشاء نفاذية الغاز للتغلب على هذه المشاكل والسماح عالية الدقة مبائر التصوير من الجلد الجنينية في فيفو السابقين الثقافة 6. باستخدام أرومة ميلانينية محددة جنة المساواة العرقية، معربا عن recombinase خط الماوس جنبا إلى جنب مع خط مراسل R26YFPR ونحن قادرون على تسمية fluorescently السكان أرومة ميلانينية داخل هذه الثقافات الجلد. يسمح تقنية التصوير الحي للmelanoblasts ومراقبة سلوكهم والتفاعل مع الأنسجة التي تتطور. يتم تضمين نتائج ممثلة لإثبات القدرة على العيش، صورة 6 الثقافات في نفس الوقت.
Introduction
وقد تم استزراع الجلد الجنينية تقليديا من قبل تشريح الجنين من الماوس وتصاعد على Nuclepore غشاء البولي. ثم يتم طرح الغشاء على مستنبت، وبالتالي الحفاظ على واجهة الهواء السائل عبر السطح من الأنسجة النامية 3،4. وقد استخدمت هذه التقنية لفحص سلوك أرومة ميلانينية عن طريق تحديد الأنسجة وتقييم توزيع أرومة ميلانينية باستخدام β-غالاكتوزيداز كعلامة 7. قمنا بتطوير طريقة تسمح melanoblasts المسمى الحية التصوير fluorescently في فيفو السابقين الثقافة الجلد 6. نحن هنا وصف الأسلوب في التفاصيل من تشريح، لإعداد، ليعيش التصوير متحد البؤر وتشمل بعض التحسينات الأخيرة.
Melanoblasts هي السلائف الجنينية من الخلايا الصباغية، والخلايا التي تنتج الصبغة في الشعر والجلد. تنشأ Melanoblasts في قمة العصبية المتاخمة للالأنبوب العصبي الجنيني في اليوم حوالي 9 (E9) في الماوس النامية البريدmbryo. في وقت لاحق تهاجر على طول الطريق بين ظهراني الأديم الظاهر وو somites النامية. في E12.5 ينتقلون من الأدمة إلى البشرة حيث تتكاثر ومواصلة هجرتهم. يبدأ نمط بصيلات الشعر الأولية لتشكيل في البشرة في E14.5 وmelanoblasts E15.5 وإضفاء الطابع المحلي لهذه المسام. لاستعراض تطوير أرومة ميلانينية / الصباغية رؤية توماس وإريكسون (2008) 1. من أجل تسمية السكان أرومة ميلانينية جمعنا :: صور حيوانات CREB التي تعبر عن لجنة المساواة العرقية-recombinase مدفوعا المروج الماوس التيروزينيز 8 مع الحيوانات R26YFPR التي تعبر عن بروتين فلوري الصفراء (YFP) مشروط من موضع ROSA26 9.
نحن تصف طريقة لثقافة الجنينية الصور والتقاط الجلد باستخدام المجهر متحد البؤر مقلوب. وتكييفه شكل طريقة الأصلي وصفها في مورت وآخرون (2010) 6. الحاضرالأسلوب يسمح التصوير في شكل 6 جيدا ويزيل الاعتماد على الأغشية Nuclepore وعلى matrigel لدعم الثقافة. بدلا من ذلك باستخدام كتلة صغيرة من 1٪ الاغاروز لتحقيق الاستقرار في الجلد الجنينية. إزالة الاعتماد على matrigel أهمية خاصة في الحالات التي تكون فيها استجابة الجلد الجنينية لعوامل النمو للذوبان هو محور الدراسة. وقد تم بالفعل استخدام طريقة لدينا الأصلي للحصول على أفكار جديدة في تطوير أرومة ميلانينية 10-13 ونحن نتوقع أن التحسينات وصفنا هنا سوف جعلها أكثر قوة باعتبارها تقنية تجريبية خاصة حيث الثقافات المتعددة والمتوازية هي شرط.
Protocol
Representative Results
Discussion
نحن تصف طريقة لثقافة الجلد الجنينية التي هي قابلة خصوصية التصوير للعيش الخلية على المجاهر مبائر مقلوب. يتضمن الأسلوب التحسينات الأخيرة التي تسمح لل6 الثقافات ليمكن تصوير بالتوازي ويزيل الاعتماد على matrigel والأغشية Nuclepore الأسلوب الأصلي 6. الفرق الفنية الحاسمة من …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل التمويل الأساسي من مجلس البحوث الطبية. نحن ممتنون لكريغ نيكول لإعداد الرسومات الفنية. نحن ممتنون لماثيو بيرسون وبول بيري لدعم التصوير الخاصة بهم.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Referências
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Biologia do Desenvolvimento. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Biologia do Desenvolvimento. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Biologia do Desenvolvimento. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
