אקס תרבות Vivo של עור העכבר עוברי וLive-הדמיה של הגירת Melanoblast
Summary
אנו מתארים את הנתיחה וvivo התרבות לשעבר של עור העוברי של עכבר. מערכת התרבות שומרת על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של הרקמות ומאפשרת הדמיה במיקרוסקופ הפוכה. Melanoblasts, רכיב של העור מתפתח, שכותרתו fluorescently המאפשרת את התנהגותם כדי להיות שנצפתה באמצעות מיקרוסקופ confocal.
Abstract
Melanoblasts הוא הרכס העצבי נגזר מבשרים של מלנוציטים; התאים אחראים לייצור הפיגמנט בעור ושיער. Melanoblasts נודדים דרך האפידרמיס של העובר שבו הם לאחר מכן ליישב את השיער מתפתח זקיקי 1,2. נדידת תאי רכס עצבית היא נחקרה בהרחבה במבחנה, אך בשיטות vivo עדיין לא מפותחות היטב, במיוחד במערכות של יונקים. חלופה אחת היא להשתמש vivo לשעבר תרבות organotypic 3-6. תרבות של עור העוברי של עכבר דורשת התחזוקה של ממשק אוויר נוזלי (עלי) על פני השטח של 3,6 הרקמות. רזולוציה גבוהה לחיות הדמיה של עור העוברי של עכבר כבר הקשתה על ידי חוסר שיטה טובה שלא רק שומרת עלי זה, אלא גם מאפשר לתרבות להיות הפוכה ולכן תואמת עם עדשות אובייקטיביות מרחק עבודה קצר ומיקרוסקופים confocal ביותר. מאמר זה מתאר שיפורים אחרונים לספידOD המשתמש בקרום חדיר גז כדי להתגבר על הבעיות אלה ולאפשר הדמיה confocal ברזולוציה גבוהה של עור עוברי in vivo התרבות לשעבר 6. באמצעות melanoblast Cre-recombinase הספציפית המבטאת קו עכבר בשילוב עם קו כתב R26YFPR אנו יכולים לתייג fluorescently אוכלוסיית melanoblast בתוך תרבויות עור אלה. הטכניקה מאפשרת לחיות הדמיה של melanoblasts והתבוננות בהתנהגות והאינטראקציות עם הרקמה בה הן לפתחם. נציג תוצאות כלולות כדי להדגים את היכולת לחיות תמונת 6 תרבויות במקביל.
Introduction
עור באופן מסורתי עוברי כבר בתרבית על ידי לנתח מן עובר העכבר וגובר על קרום Nuclepore פוליקרבונט. הקרום אז ריחף במדיום התרבות, ובכך שמירה על ממשק אוויר נוזלי על פני השטח של רקמת פיתוח 3,4. טכניקה זו נעשתה שימוש כדי assay התנהגות melanoblast ידי תיקון הרקמות והערכת הפצת melanoblast באמצעות β-galactosidase כסמן 7. פיתחנו שיטה המאפשרת melanoblasts כותרת חי הדמיה של fluorescently בvivo לשעבר תרבות עור 6. כאן אנו מתארים את השיטה בפירוט מנתיחה, להתקנה, לחיות confocal הדמיה וכוללים כמה שיפורים אחרונים.
Melanoblasts הם המבשרים העובריים של המלנוציטים, התאים המייצרים פיגמנט בשיער ועור. Melanoblasts להתעורר ברכס העצבי הסמוך לצינור העצבי סביב היום עוברי 9 (E9) בשעה בדואר עכבר הפיתוחmbryo. כתוצאה מכך הם נודדים לאורך מסלול dorsolateral בין האאקטודרם וsomites המתפתח. בE12.5 הם עוברים מהדרמיס לאפידרמיס שבו הם מתרבים וממשיכים ההגירה שלהם. דפוס זקיק השיער הראשוני מתחיל להיווצר באפידרמיס ובE14.5 ידי melanoblasts E15.5 הם לוקליזציה לזקיקים אלה. לסקירה של התפתחות melanoblast / מלנוציט לראות תומאס ואריקסון (2008) 1. כדי לתייג אוכלוסיית melanoblast יש לנו שילוב Tyr :: בעלי החיים CREB המבטאים Cre-recombinase מונעת על ידי האמרגן טירוסינאז העכבר 8 עם חיות R26YFPR המבטאות חלבון פלואורסצנטי צהוב (YFP) על תנאי מלוקוס ROSA26 9.
אנו מתארים שיטה לתמונות עור ולכידה עוברית תרבות באמצעות מיקרוסקופ confocal הפוך. הוא מותאם צורת השיטה המקורית שתוארה במורט et al. (2010) 6. העכשווישיטה מאפשרת הדמיה בפורמט 6 היטב ומסירה את ההסתמכות על ממברנות Nuclepore ועל matrigel לתמוך בתרבות. במקום באמצעות בלוק קטן של 1% agarose כדי לייצב את העור העוברי. הסרת ההסתמכות על matrigel חשוב במיוחד במצבים שבם התגובה של העור העוברי לגורמי גדילה מסיסים היא המוקד של מחקר. השיטה המקורית שלנו כבר הייתה בשימוש כדי להשיג תובנות חדשות פיתוח melanoblast 10-13 ואנו צופים כי השיפורים שאנו מתארים כאן יעשו את זה חזק יותר כטכניקה ניסויית במיוחד שבו תרבויות מקבילות מרובות הן דרישה.
Protocol
Representative Results
Discussion
אנו מתארים שיטה לעור עוברי תרבות שהיא ייחוד נוח הדמיה לחיות תאים במיקרוסקופי confocal הפוכים. השיטה כוללת שיפורים אחרונים שמאפשרים 6 תרבויות להיות צילמו במקביל ומסירה את ההסתמכות על matrigel וקרומים Nuclepore של השיטה המקורית 6. ההבדל הטכני החיוני מטכניקות דומות הוא השימו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה נתמכה על ידי מימון ליבה מהמועצה למחקר הרפואי. אנו מודים לקרייג ניקול להכנת שרטוטים טכניים. אנו מודים למתיו פירסון ופול פרי על תמיכת ההדמיה שלהם.
Materials
| DMEM high glucose | Biochrom AG | F0475 | without phenol red |
| Penicillin | Sigma | P3032 | |
| Streptomycin | Sigma | S9137 | |
| Fetal calf serum | Hyclone | SV30160.03 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-038 | |
| Ethanol | Generic | ||
| Live imaging chamber | Custom made | ||
| Lummox dishes | Sarstedt | 94.6077.410 | |
| 6-well plate | Greiner Bio-One | 657-160 | |
| Single edged razor blade | Fisher Scientific | 1244-3170 | |
| Agarose | Biogene | 300-300 | |
| Fine pastette | Generic | ||
| PBS | Generic | ||
| Kebab skewers | Waitrose | Bamboo BBQ skewers 30cm | |
| Toothbrush | Generic | ||
| Petri dishes | Greiner Bio-One | 633185 | |
| Suture thread | Look | SP115 | Black silk suture thread |
Referências
- Thomas, A. J., Erickson, C. A. The making of a melanocyte: the specification of melanoblasts from the neural crest. Pigment Cell & Melanoma Research. 21 (6), 598-610 (2008).
- Mayer, T. C. The migratory pathway of neural crest cells into the skin of mouse embryos. Biologia do Desenvolvimento. 34 (1), 39-46 (1973).
- Kashiwagi, M., Huh, N., Turksen, K. Organ Culture of Developing Mouse Skin and Its Application for Molecular Mechanistic Studies of Morphogenesis. Epidermal Cells: Methods and Protocols. 289, 39-45 (2005).
- Kashiwagi, M., Kuroki, T., Huh, N. Specific inhibition of hair follicle formation by epidermal growth factor in an organ culture of developing mouse skin. Biologia do Desenvolvimento. 189 (1), 22-32 (1997).
- Van Der Wel, L. I., Wei, L., Prens, E. P., Laman, J. D., Companjen, A. R. A modified ex vivo skin organ culture system for functional studies. Archives of Dermatological Research. 293 (4), 184-190 (2001).
- Mort, R. L., Hay, L., Jackson, I. J. Ex vivo live imaging of melanoblast migration in embryonic mouse skin. Pigment Cell & Melanoma Research. 23 (2), 299-301 (2010).
- Jordan, S. A. A., Jackson, I. J. J. MGF (KIT ligand) is a chemokinetic factor for melanoblast migration into hair follicles. Biologia do Desenvolvimento. 225 (2), 424-436 (2000).
- Delmas, V., Martinozzi, S., Bourgeois, Y., Holzenberger, M., Larue, L. Cre-mediated recombination in the skin melanocyte lineage. Genesis. 36 (2), 73-80 (2003).
- Srinivas, S., et al. Cre reporter strains produced by targeted insertion of EYFP and ECFP into the ROSA26 locus. BMC Developmental Biology. 1 (1), (2001).
- Li, A., et al. Rac1 Drives Melanoblast Organization during Mouse Development by Orchestrating Pseudopod. Driven Motility and Cell-Cycle Progression. Developmental Cell. 21 (4), 722-734 (2011).
- Li, A., et al. Activated Mutant NRas(Q61K) Drives Aberrant Melanocyte Signaling, Survival, and Invasiveness via a Rac1-Dependent Mechanism. The Journal of Investigative Dermatology. , 1-12 (2012).
- Schachtner, H., et al. Tissue inducible Lifeact expression allows visualization of actin dynamics in vivo and ex vivo. European Journal of Cell Biology. 91 (11-12), 923-929 (2012).
- Ma, Y., et al. Fascin 1 is transiently expressed in mouse melanoblasts during development and promotes migration and proliferation. Development. 140 (10), 2203-2211 (2013).
- Danielian, P. S., Muccino, D., Rowitch, D. H., Michael, S. K., McMahon, A. P. Modification of gene activity in mouse embryos in utero by a tamoxifen-inducible form of Cre recombinase. Current Biology. 8 (24), 1323-1326 (1998).
- Shea, K., Geijsen, N. Dissection of 6.5 dpc mouse embryos. Journal of Visualized Experiments. (2), (2007).
