Laserinduzierte Plasmaspektroskopie: ein neuer Ansatz für die Nanopartikel-Mapping und Quantifizierung in Organgewebe
Summary
Laser-Emissionsspektroskopie an dünnen Organ-und Tumorgewebe durchgeführt erfolgreich erkannt natürlichen Elemente und künstlich injiziert Gadolinium (Gd), von Gd-Nanopartikel auf der Basis ausgestellt. Bilder von chemischen Elementen erreicht eine Auflösung von 100 um und quantitative Unter mM Empfindlichkeit. Die Kompatibilität der Einrichtung mit optischen Standardmikroskop hebt das Potential, um mehrere Bilder von einer gleichen biologischen Gewebes bereitzustellen.
Abstract
Emissionsspektroskopie des laserinduzierten Plasmas wurde einer Elementaranalyse biologischer Proben. Laser-Induced Breakdown-Spektroskopie (LIBS) auf Dünnschnitten von Gewebe durch Nagetier: Nieren-und Tumor, ermöglicht die Erkennung von anorganischen Elementen wie (i) Na, Ca, Cu, Mg, P und Fe, die natürlich im Körper vorhanden ist und (ii) Si und Gd, erfasst nach der Injektion von Gadolinium-basierte Nanopartikel. Wurden die Tiere eingeschläfert 1 bis 24 h nach intravenöser Injektion von Partikeln. Eine zweidimensionale Abtastung der Probe unter Verwendung eines motorisierten Mikrometer 3D-Stufe erlaubt die Infrarot-Laserstrahl Erkundung der Oberfläche mit einer lateralen Auflösung von weniger als 100 μ m. Quantitative chemische Bilder von Gd-Element innerhalb der Orgel wurden mit sub-mm-Empfindlichkeit. LIBS bietet eine einfache und robuste Methode, um die Verteilung der anorganischen Materialien ohne spezielle LABÉLI studierenng. Darüber hinaus ist die Kompatibilität der Einrichtung mit optischen Standardmikroskop hebt das Potential, um mehrere Bilder des gleichen biologischen Gewebes mit verschiedenen Arten von Antwort zu geben: Elementar, molekularen oder zellulären.
Introduction
Die breite Entwicklung der Nanopartikel für biologische Anwendungen parallel forderte die Verbesserung der analytischen Techniken für ihre Quantifizierung und Bildgebung in biologischen Proben. Üblicherweise die Detektion und die Abbildung der Nanopartikel in Organe durch Fluoreszenzmikroskopie oder konfokaler. Leider erfordern diese Verfahren die Markierung der Nanopartikel von einer Nahinfrarot-Farbstoff, der die biologische Verteilung der Nanopartikel besonders für sehr kleine Nanopartikel aufgrund ihrer hydrophoben Eigenschaften modifizieren können. Der Nachweis von Nanopartikeln markiert und vor allem die sehr kleinen Nanopartikel (Größe <10 nm), könnte daher mit ihren biologischen Verteilung stören am ganzen Körper Skala, sondern auch an den Gewebe-und Zell Ebenen. Die Entwicklung der neuen Geräte in der Lage, Nanopartikel ohne Kennzeichnung zu erkennen bietet neue Möglichkeiten für die Untersuchung von deren Verhalten und Kinetik. Außerdem ist die Rolle von Spurenelementen wie Eisen und Kupfer in eine Gehirnerkrankungend neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer 1, Menkes 2,3 oder 4 Wilson vorschlagen, das Interesse zu studieren und zu lokalisieren, die diese Elemente in Geweben.
Verschiedene Techniken sind verwendet worden, um Elementverteilungs oder Mikroanalyse von verschiedenen Materialien. In ihrer 2006 veröffentlichten Übersichtsarbeit, R. lobinski et al. Einen Überblick der verfügbaren Standardtechniken für die Mikroelementaranalyse in biologischen Umgebung, einer der anspruchsvollsten Umgebungen für analytische Wissenschaften 5. Die Elektronenmikrosonde, die von energiedispersiven Röntgenmikroanalyse in einem Transmissions-Elektronenmikroskop besteht, kann zu zahlreichen Studien angewendet werden, wenn der Elementkonzentration ausreichend ist (> 100-1.000 &mgr; g / g). Um niedrigere Nachweisgrenzen zu erreichen, haben die folgenden Techniken verwendet:
- Ionenstrahl-Mikropartikel mit induzierte Röntgenemission μ-PIXE (1-10 &mgr; g / g) 6
- synchrotronstrahlung Mikroanalyse μ-SXRF (0,1-1 g / g) 7
- Sekundärionen-Massenspektrometrie SIMS (0,1 ug / g) 8
- Laserablation induktiv gekoppelte Massenspektrometrie LA-ICP-MS (bis zu 0,01 g / g) 9,10
Die oben erwähnten Techniken bieten mikrometrischer Auflösung wie in der Tabelle 1 von lobinski et al extrahiert gezeigt.
3D-Rekonstruktion von seriellen 2D-Untersuchungen könnte auch für den Wiederaufbau der tieferen Gewebe 11 vorgeschlagen werden. Alle Geräte und Systeme erfordern jedoch sowohl qualifizierte Fachkräfte, mäßig bis stark teure Ausrüstung und lang anhaltende Experimente (in der Regel mehr als 4 Stunden für eine 100 um · 100 um für μ-SXRF und 10 mm x 10 mm für die LA-ICP-MS ) 12. Insgesamt machen diese Anforderungen elementare Mikroanalyse sehr einschränkenden und mit herkömmlichen optischen Abbildungssystemen nicht kompatibel,Fluoreszenzmikroskopie oder nichtlineare Mikroskopie. Ein weiterer Punkt, den wir hier zu erwähnen ist, dass der quantitative Messfähigkeit ist noch recht begrenzt und hängt von der Verfügbarkeit der Matrix abgestimmt Laborstandards. Die weitere Verallgemeinerung der Verwendung von elementarem Mikroanalyse in Industrieprozessen, Geologie, Biologie und anderen Bereichen der Anwendungen erhebliche konzeptionelle und technologische Durchbrüche zu erzeugen.
Der Zweck der vorliegenden Manuskript ist es, Lösungen für die quantitative Elementar Mapping (oder Mikroelementaranalyse) in biologischen Geweben mit einer Tisch Instrumentierung voll kompatibel mit herkömmlichen optischen Mikroskopie vorgeschlagen. Unser Ansatz basiert auf dem Laser-Induced Breakdown-Spektroskopie (LIBS-Technologie) basiert. In LIBS wird ein Laserimpuls auf der interessierenden Probe fokussiert, um den Abbau und die Funken des Materials zu erstellen. Die atomare Strahlung im Plasma emittierte wird anschließend von einem Spektrometer analysiert und der elementarental-Konzentrationen können mit Kalibrierungsmessungen durchgeführt, vorher 13,14 abgerufen werden. Die Vorteile umfassen LIBS Empfindlichkeit (g / g für fast alle Elemente), Kompaktheit, sehr einfache Probenvorbereitung, ohne Kontakt mit der Probe, sofortige Reaktion und präzise lokalisiert (Mikro)-Oberflächenanalyse. Die Anwendung von Gewebe chemische Bildgebung bleibt jedoch eine Herausforderung, da die Laser-Ablation von Gewebe muss fein gesteuert, um Karten mit hoher räumlicher Auflösung zusammen mit Empfindlichkeit in der ug / g-Bereich 15,16 durchzuführen.
Mit einer solchen Lösung ist die Hinzunahme von Tracern oder Markierungsmittel nicht benötigt, das Erkennen ermöglicht anorganische Elemente direkt in ihrer natürlichen Umgebung in biologischen Geweben. Die LIBS Instrument in unserem Labor entwickelt bietet eine aktuelle Auflösung geringer als 100 &mgr; m mit einem geschätzten Empfindlichkeit Gd unter 35 ug / g, entsprechend 0,1 mM 16, die ermöglichtdie Abbildung von großen Proben (> 1 cm 2) innerhalb von 30 min. Darüber hinaus erleichtert die hausgemachte Software die Übernahme und Nutzung der Daten. Dieses Instrument wird verwendet, um zu erfassen, anzeigen, und die Quantifizierung der Gewebeverteilung von Gadolinium (Gd)-Nanopartikel, 17. – 18. in Nieren und Tumorproben von Kleintieren, 1 bis 24 h nach der intravenösen Injektion der Partikel (Größe <5 nm) . Anorganischen Elementen, die an sich in einem biologischen Gewebe enthalten sind, wie Fe, Ca, Na und P, wurden ebenfalls festgestellt und abgebildet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Um biologische Probe aufgebracht wird, ermöglicht diese Technik die chemische Bildgebung, dh die Zuordnung und Quantifizierung von Gd und Si aus injiziert Gd-basierte Nanopartikel in verschiedenen Organen. Von den wichtigsten kritischen Einstellungen, ist die Steuerung der Lasereigenschaften (Wellenlänge, Pulsenergie, wobei der Schwerpunkt und Stabilität) entscheidend für eine präzise und feine Gewebeabtragung (dh Zuordnung Auflösung) als auch für Sensibilität. Arbeiten bei hoher Energie liefer…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren danken finanzielle Unterstützung durch die Labex-Imust.
Materials
| Laser nanosecond Nd:YAG | Quantel | Brillant | 5ns pulse witdh, wavelength 1064 nm |
| Spectrometer | Andor Technology | Shamrock 303 | with 1200 l/mm blazed at 300 nm grating |
| Detector ICCD | Andor Technology | Istar | 2 ns temporal resolution |
| LIBS Unit | ILM | Homemade Instrumentation | |
| Gd-based nanoparticles | Nano-H | particles | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | for particle's dilution |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 21108 | for particle's dilution |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S5886 | for particle's dilution |
| mice | Charles River | depending of animal breeding | |
| isoflurane | Coveto / Virbac | for anaesthesia – Isofluranum | |
| isopentane | Sigma-Aldrich | 59060 | to froze the sample slowly |
| liquide nitrogen | Air Liquide | to cool down the isopentane | |
| cryostat | Leica | CM-3050S | to slide the samples |
| petri dishes | Dutscher | 353004 | to stick the sample |
Referências
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