Dieses Protokoll beschreibt extrazellulären Aufnahme der Aktionspotentialantworten durch labellar Geschmack Neuronen in Drosophila gefeuert.
Die periphere Geschmack Reaktion der Insekten können kraftvoll mit elektrophysiologischen Methoden untersucht werden. Die hier beschriebene Methode ermöglicht es dem Forscher, Geschmacks Antworten direkt und quantitativ zu messen, was die sensorischen Input, dass die Insektennervensystem erhält von Geschmack Reize in seiner Umgebung. Dieses Protokoll beschreibt alle wichtigen Schritte bei der Durchführung dieser Technik. Die kritischen Schritte in die Montage eines Elektrophysiologie-rig, wie die Auswahl der notwendigen Ausrüstung und eine geeignete Umgebung für die Aufnahme, abgegrenzt werden. Wir beschreiben auch, wie man für die Aufnahme durch entsprechende Referenz-und Aufzeichnungselektroden vorzubereiten und Geschmacksstoff-Lösungen. Wir beschreiben im Detail die für die Herstellung des Insekten durch Einsetzen einer Glasreferenzelektrode in die Fliege um den Rüssel zu immobilisieren verwendete Methode. Wir zeigen Spuren der elektrischen Impulse durch Geschmack Neuronen in Reaktion auf eine Zucker-und eine bittere Verbindung gefeuert. Aspekte des Protokolls sind Technically Herausforderung und wir auch eine umfangreiche Beschreibung von einigen gemeinsamen technischen Herausforderungen, die auftreten können, wie der Mangel an Signal-oder übermäßiges Rauschen in das System, und mögliche Lösungen. Die Technik stößt an ihre Grenzen, wie zum Beispiel die Unfähigkeit, zeitlich komplexe Reize liefern, beachten Hintergrund Brennen unmittelbar vor der Auslieferung Stimulus oder verwenden wasserunlösliche Verbindungen bequem Geschmack. Trotz dieser Einschränkungen ist diese Technik (einschließlich geringfügige Änderungen im Protokoll Bezug genommen) ein Standard, breit akzeptiertes Verfahren für die Aufzeichnung von Drosophila neuronalen Antworten auf Verbindungen zu probieren.
Der Geschmackssinn kann ein Insekt eine breite Palette von lösliche Chemikalien zu erkennen und spielt eine wichtige Rolle bei der Akzeptanz einer nahrhaften Substanz oder die Ablehnung eines schädlichen oder giftigen ein. Geschmack ist auch gedacht, um eine Rolle bei der Partnerwahl spielen, durch den Nachweis von Pheromonen 1-5. Diese wichtige und vielfältige Funktionen haben das Insekt Geschmack System ein überzeugendes Ziel von Ermittlungen, wie sensorische Systeme übersetzen Umweltreize in relevante Verhaltens Ausgänge gemacht.
Die Primäreinheit der Drosophila melanogaster Geschmack System ist der Geschmack Haar oder Sensillum. Moleküle geben Sie die Sensillum über eine Poren an seiner Spitze 2,6. Sensillen auf der Lippe, der Beine, der Flügel-Marge und des Rachens 6 gefunden. Auf der Lippe, wird die Anzahl und Lage der Sensillen stereotyp. Es gibt drei Klassen von morphologischen Sensillen je nach Länge: die Länge (L), Mittelstufe (I) und kurze (S ) Sensillen 7,8. Jeder Sensillum enthält entweder zwei (I-Typ) oder vier (L-und S-Typ) Geschmacksrezeptorzellen (KNS) 9. Verschiedene KNS reagieren auf verschiedene Kategorien von Geschmack Reize: bitter, Zucker, Salz und Osmolarität 7,10 und Express unterschiedliche Untergruppen von Geschmacksrezeptoren 8,11-13. Nur I und S-Typ-Sensillen enthalten Bitter-responsive KNS 8,10. Die KNS Projekt auf die Unterschlundganglion Ganglion (SOG) und deren Aktivierung durch Geschmacksmoleküle auf den höheren zentralen Nervensystems für die Decodierung weitergeleitet, was zu einer Verhaltensreaktion 6. Die relativ kleine Zahl von Neuronen und die Zugänglichkeit für Molekular-und Verhaltensanalyse machen den Geschmack Drosophila-System ein hervorragendes Modell für die Untersuchung von Geschmacks-Systeme im Allgemeinen. Die relative Leichtigkeit, mit der das System über genetische Mutation oder der GAL4-UAS Expressionssystem manipuliert werden, dient auch als ein wertvolles Werkzeug 14,15.
NHALT "> Da diese Sensillen ragen aus der Oberfläche der Lippe, machen sie hervorragende Ziele für die Elektrophysiologie. Das Brennen der KNS kann mit extrazellulären Aufnahme überwacht werden. Historisch gesehen, die Seitenwand-Aufzeichnungsverfahren, das eine Glaselektrode in die eingelegte verwendet Sensillum neuronale Aktivität aufzuzeichnen, 26 verwendet. Jedoch ist dieses Verfahren technisch schwierig zu führen, und es ist schwierig, lange von jedem Präparat aufzunehmen. Die Spitze-Aufzeichnungsverfahren, das die Reaktion der Neuronen mit einer Elektrode Maßnahmen, gleichzeitig liefert ein Geschmacksträger ist, da die Methode der Wahl 9,16 zu werden. Es wurde verwendet, um den Geschmack System von Drosophila melanogaster 8,10,17,18 sowie eine Reihe von anderen Insektenarten 19-23 zu untersuchen. Es hat wurde durch die Entwicklung der tastePROBE Verstärker, der eine der wichtigsten Nachteile der Spitze-Aufzeichnungsverfahren durch Kompensation erleichtert wandDie große Potentialdifferenz zwischen der Bezugselektrode und der Insekten Sensillum, so dass die GRN Aktionspotentiale ohne übermäßige Verstärkung oder Filterung 24 aufgezeichnet werden. Eine weitere wichtige Entwicklung war die Verwendung von Citrat als tricholine der Aufnahme Elektrolyt 25. TCC unterdrückt Antworten von der Osmolarität empfindlichen GRN und nicht stimulieren die salzempfindlichen GRN, so dass Reaktionen, die durch bittere Geschmacksstoffe und Zucker erzeugt viel einfacher zu analysieren 25.Hier beschreiben wir, wie Spitze Aufnahme von Drosophila labellar Sensillen ist derzeit in der Carlson Labor durchgeführt. Dieses Protokoll wird erklären, wie man einen geeigneten Elektrophysiologie rig, wie die Fliege vorzubereiten, und wie man Geschmack Aufnahmen durchführen zu etablieren. Auch bei der Verwendung dieses Wir präsentieren einige durch die Aufnahme von Teilmengen von Drosophila Sensillen, sowie einige häufig auftretende Probleme und mögliche Lösungen, die auftreten können, erhalten repräsentative DatenTechnik.
Labellar sensilla unterscheiden sich in der Leichtigkeit der Aufnahme aufgrund von Unterschieden in der Morphologie und Anatomie Organisation. Manchmal ist ein Sensillum auf keine Geschmacksstoffe reagieren, auch eine, die dafür bekannt ist, eine positive Antwort zu entlocken. Die Häufigkeit, mit der dies geschieht, hängt von der Aktivität Sensillum. L Sensillen sind durchweg ansprechend und sind relativ einfach, aufgrund ihrer Länge zugreifen. Im Allgemeinen sind die S Sensillen konsequent reagiert, aber ihre kurz…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch ein Promotions NRSA Zuschuss 1F31DC012985 (RD) und NIH Zuschüsse an JC unterstützt
Wir danken Herrn Dr. Weiss Linnea für hilfreiche Kommentare zum Manuskript, Dr. Joseph Ryan um Hilfe Kompilieren Zahlen danken und Dr. Frederic Marion-Poll für hilfreiche technische Beratung. Wir würden auch gerne die hilfreichen Kommentare von vier Rezensenten bestätigen.
Stereo Zoom Microscope | Olympus | SZX12 DFPLFL1.6x PF eyepieces: WHN10x-H/22 | capable of ~150x magnification with long working distance table mount stand |
Anti-vibration Table | Kinetic Systems | BenchMate2210 | |
Micromanipulators | Narishige | NMN-21 | |
Magnetic stands | ENCO | Model #625-0930 | |
Reference Electrode Holder | Harvard Apparatus | ESP/W-F10N | Can be mounted on 5ml serological pipette for extended range |
Silver Wire | World Precision Instruments | AGW1510 | 0.3-0.5mm diameter |
Retort Stand | generic | ||
Outlet Plastic Tube | generic, 1cm diameter | ||
Flexible Plastic Tubing | Nalgene | 8000-0060 | VI grade 1/4 in internal diameter |
500 ml Conical Flask | generic, with side arm | ||
Aquarium Pump | Aquatic Gardens | Airpump 2000 | |
Fiber Optic Light Source | Dolan-Jenner Industries | Fiber-Lite 2100 | |
White Card/Paper | Whatman | 1001-110 | |
Digital Acquisition System | Syntech | IDAC-4 | Alternative: National Instruments NI-6251 |
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Tasteprobe Amplifier | Syntech | DTP-1 | Tasteprobe |
Alligator Clips | Grainger | 1XWN7 | Any brand is fine |
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Gold Connector Pins | World Precision Instruments | 5482 | |
Personal Computer | Dell | Vostro | Check for compatibility with digital acquisition system and software |
Acquisition Software | Syntech | Autospike | Autospike works with IDAC-4; alternatively, use Labview with NI-6251 |
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Borosilicate Glass Capillaries | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Pipette Puller | Sutter Instrument Company | Model P-87 Flaming/Brown Micropipette Puller | |
Beadle and Ephrussi Ringer Solution | See recipe in protocol section | ||
Tricholine citrate, 65% | Sigma | T0252-100G | |
Stereo Microscope | Olympus | VMZ 1x-4x | Capable of 10x-40x magnification |
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Plastic Tubing | Tygon | R-3603 |