Nós descrevemos uma série de métodos para injectar corantes, os vectores de ADN, vírus e células, a fim de controlar tanto o destino celular e fenótipo das células endógenas e enxertados derivados de células embrionárias ou pluripotentes dentro de embriões de ratinho no dia embrionário (E) 9,5 e as fases posteriores de desenvolvimento.
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Artigo de método
Rotulagem celular e injeção em Desenvolvimento embrionárias corações do rato
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Testando o destino de células-tronco embrionárias de derivativos ou pluripotentes in vitro protocolos levou a resultados controversos que não necessariamente refletem seu potencial in vivo. De preferência, essas células devem ser colocados num ambiente embrionária adequada, a fim de adquirir o seu fenótipo definitiva. Além disso, células de linhagem rastreamento estudos no rato após marcação das células com corantes ou vetores retrovirais permanece mais limitada a embriões de camundongos em fase inicial com órgãos ainda pouco desenvolvidos. Para superar essas limitações, nós projetamos protocolos microinjeção padrão e mediada por ultra-som para injetar vários agentes em regiões-alvo do coração em embriões de camundongos em E9.5 e estágios mais avançados de desenvolvimento. Explante embrionárias ou embriões são então cultivados ou à esquerda para continuar a desenvolver no útero. Esses agentes incluem corantes fluorescentes, vírus, shRNAs, ou células-tronco progenitoras derivadas de células. Nossos abordagens permitir preservação do function do órgão durante o acompanhamento de migração e destino de células marcadas e / ou injetadas. Estas tecnologias podem ser estendidos a outros órgãos e será muito útil para abordar questões biológicas fundamentais em biologia do desenvolvimento.
Introdução
Mais de uma década atrás, as células-tronco embrionárias humanas (HuESCs) foram derivadas de blastocistos humanos 1. Desde então, estas células tornaram-se objecto de um importante campo de pesquisa que aborda questões não satisfeitas em biologia do desenvolvimento humano. HuESCs ter ainda fornecido esperanças na medicina regenerativa. Nos últimos anos, as células estaminais pluripotentes humanas induzidas (iPSCs) foram geradas a partir de células somáticas de doentes específica, o fornecimento de modelos de doença genética 2. Muitos em protocolos in vitro para a diferenciação de células-tronco pluripotentes induzidas ou embrio....
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Protocolo
1. Preparação
Procedimentos com animais
Obter a aprovação de um comitê de ética animal e seguir as orientações institucionais para o trabalho com o vírus, HuESC e / ou iPSC (quando aplicável), bem como a movimentação do mouse, a obtenção de embriões de camundongos, e realizar a cirurgia mouse. Para acasalamentos programados, o dia do plugue é considerado dia embrionário (E) 0,5 / 0,5 dias pós-coitum.
- Agulhas microinjeção:
Para ex utero microinjeção, puxe pipetas de vidro (1,2 milímetros de diâmetro tubos de borosilicato capilares externos) utilizando um extrator pipeta / beveller par....
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Resultados
Utilizando os protocolos de injecção descritos acima, as células podem ser identificadas e / ou injectado no coração embrionário do rato. Como prova do conceito, vários exemplos são mostrados na qual o protocolo de injecção e o ex vivo AVC explante, isolado do coração, ou a cultura do embrião inteiro foram combinadas (Figura 1).
A Figura 1 mostra a preparação do embrião, antes da injecção das células. O embrião E9.5 é removido da sua decidua, manten.......
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Discussão
Os ex vivo protocolos de injeção intra-cardíacas descritas acima são projetados para preservar a função miocárdica por pelo menos 48 horas, em meados de estágio (E9.5-E11.5) embriões de camundongos. Estas abordagens de injecção de permitir a injecção espacialmente direccionada de DNA ou células. Os poucos exemplos mostrados nas Figuras 1-3 fornecer prova de conceito para delinear ex vivo e em mecanismos moleculares in vivo de processos de desenvolvimento que ocorrem e.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Os autores agradecem o Leducq Foundation (mitral) ea Agence Nationale pour la Recherche (ANR conceder Specistem) para o financiamento desta pesquisa.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Setups/Hardware | |||
| 40 MHz Transdutor | VisualSonics | MS550S | |
| Microinjetor | VisualSonics | ||
| Microinjetor | Eppendorf | 5242 | |
| Micromanipulador | Eppendorf | 5171 | |
| Nitrogênio | necessário para pressurizar o injetor | ||
| Sistema de trilhos | VisualSonics | ||
| rotador | para girar o tubo de vidro com embriões dentro da incubadora | ||
| Incubadora | 5% CO2, 37 ° C | ||
| estereomicroscópio | Zeiss | Discovery. V8 | |
| Vevo 2100 | VisualSonics | ||
| Microinjection | |||
| Tubos capilares de borosilicato | World Precision Instrument | KTW-120-6 | 1.2-μ m diâmetro externo |
| Extrator de pipetas | Sutter | Modelo P87 | |
| Agulhas de microinjeção | Origio-Humagen | C060609 | OD/ID 1,14 mm/53 mm, com 50/35 μ m OD/ID tip |
| Hamilton seringas | |||
| Placas | 10 cm de diâmetro | ||
| Óleo mineral | Sigma | M8410 | |
| Membrana de silicone | Visualsonics | 4.3 x 4.3 cm | |
| Play-Doh | |||
| Isoflurano | Vet Um | ||
| agente de depilação | Lubrificante para os olhos Nair | ||
| Optixcare | 31779 | ||
| Gel de eletrodo (Signa) | Parker | ||
| Sutura | Sofsilk 5-0 | S1173 | |
| Gel de ultrassom | Aquasonic | ||
| Buprenex Buprenex (cloridrato de buprenorfina) | Reckitt Benckiser Pharmaceuticals Inc. | NDC 12496-0757-1 | 0,05-0,1 mg/kg em solução salina |
| Outros | |||
| silicone | Dow Corning | Sylgard 184 | |
| Petriplacas de vidro | Ferramentas de ciência | 60 mm de diâmetro | |
| Ferramentas de ciência fina | 26002-20 | ||
| Reagentes de mídia e cultura | |||
| Optimem medium | Life Technologies | 51985026 | |
| M2 medium | Sigma | M7167 | |
| Dulbecco' s Eagle Medium | Lonza | BE12-640F | glicose alta e 50% soro de rato |
| M16 médio Sigma | M7292 | ||
| Soro de rato | Janvier | ODI 7158 | |
| Penoniclina / estreptomicina | Life Technologies | 15140-12 | |
| oxigênio 40% | Líquido | necessário para oxigenar o meio de cultura de embriões Soro | |
| fetal de bezerroFisher | RVJ35882 | ||
| Matrigel | BD | 356230 | |
| Colágeno tipo I | BD | 354236 | para revestir placas de cultura para explante Placas |
| cultura | Dutcher /Orange | 131020 | |
| Injeta | |||
| CDCFDA-SE | Invitrogen/Molecular Probes | C1165 | 25 mg/ml de DMSO. Armazene a -20 °C. Dilua 1:100-200 em solução salina antes de usar. |
| Lentivírus que expressa PGK-GFP | ~8E9 unidades de transdução/ml DMEM | ||
| Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668019 |
Referências
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131, 861-872 (200....
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Reimpressões e permissões
