Isolering og dyrkning af Voksen Mouse kardiomyocytter for cellesignalering og<em> In vitro</em> Hjertehypertrofi

Summary

Vi beskriver en pålidelig metode til isolering af voksne mus cardiomyocytter. Denne protokol giver et ensartet resultat til dyrkning af funktionelle voksne kardiomyocytter fra en række af genetisk modificerede mus.

Abstract

Teknologiske fremskridt har gjort genmodificerede mus, herunder transgene og gen-knockout-mus, et vigtigt redskab i mange forskningsområder. Voksen cardiomyocytes er bredt accepteret som en god model for hjerte-cellulær fysiologi og patofysiologi samt til farmaceutisk intervention. Genetisk modificerede mus udelukker behovet for komplicerede cardiomyocyte infektion processer til at generere den ønskede genotype, som er ineffektive på grund af cardiomyocytter 'terminal differentiering. Isolering og dyrkning af høj kvantitet og kvalitet funktionelle cardiomyocytes vil dramatisk gavne hjerte-kar-forskning og give et vigtigt redskab til celle signalering transduktion forskning og udvikling af lægemidler. Her beskriver vi en veletableret metode til isolering af voksne mus cardiomyocytes, der kan gennemføres med lidt træning. Musen hjerte udskåret og kanyle til en isoleret hjerte-system, og derefter perfunderet med en calcium-fri og høj potassium puffer efterfulgt af type II collagenasefordøjelse i Langendorff retrograd perfusion mode. Denne protokol giver et ensartet resultat til indsamling af funktionelle voksen mus cardiomyocytter fra en række af genetisk modificerede mus.

Introduction

Cardiomyocytter ikke proliferativ. Der er nogle atrielle cardiomyocyte cellelinjer, som HL-1 og AT-1-celler afledt fra mus atrielle tumorer; men der er ingen voksne ventrikulære cardiomyocyte cellelinjer til rådighed for forskningen. Primære cellekulturer af voksne mus cardiomyocytes giver en kraftfuld model for hjerte forskning på de cellulære og molekylære niveau. Til dato har de været brugt i udstrakt grad til biokemiske, fysiologiske og farmakologiske forskning ^1.. Derudover har den hyppige brug af genetisk modificerede mus nødvendiggjort effektive metoder til cardiomyocyte isolation. Renkultur giver mulighed for betingelser fri interaktion med andre organer og den systemiske cirkulation, såsom gennem endogene neurohormonal og hormon-lignende faktorer ^2,3. Vellykket isolering af cardiomyocytes Dog kan være udfordrende.

Protokollen vi indfører heri er baseret på vores erfaringer med voksne rotter cardiomyocytes og beskrevet af O'Connell et al ^4,5 metode. Især i 2007 ^5, de beskrev detaljerede teknikker fra buffer præparater til cellekultur og funktionel analyse. Da mus myocytes er meget modtagelige for kontraktur forhold til rotte cardiomyocytes er de buffere eller medier, der anvendes til perfusion, fordøjelse, Ca ^{2 +} tolerance, plating og kultur i muse-protokol suppleret med en uspecifik excitation-kontraktion kobling inhibitor, 2, 3-butandion monoxime (BDM) for at hæmme deres spontane sammentrækning, dermed levedygtighed og udbyttet af stavformede myocytes forbedres markant. I protokollen indføres her, er myocytterne separeret i en høj kalium buffer fra den isolerede hjerte ved modificeret Langendorff perfusion med type II collagenase. Collagenase II effektivt nedbryder den intercellulære matrix og frigiver cellerne. Perfusionsopløsningen holder også cellulær metabolisme på et lavt niveau ^6. I additipå den isolerede hjerte system fra Harvard Apparatus vi brugt her er godt designet til præcis temperatur og konstant tryk kontrol ^7. Denne fremgangsmåde giver meget reproducerbare præparater og ensartede populationer af enkelt celletype, som kan anvendes i dyrkning natten over til måling signalproteiner eller 2-3 dages kultur for hjerte hypertrofiske assays.

Protocol

Al forskning på mus blev udført i henhold til procedurer og retningslinjer for National Institutes of Health, og de protokoller, blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg University of Toledo, College of Medicine og Life Sciences. 1.. Perfusionssystem Forberedelse Dagen før isolation, udfylde hele perfusion (herunder reservoirer) med en opløsning af hurtig alkalisk rester vaskemiddel. Lad opløsningen suge ind i systemet i et par timer eller natten over. <…

Representative Results

1.. Vellykket Isolation Kvantificering To kriterier anvendes til at kvantificere succes isolation: første, det samlede antal cardiomyocytes isolerede, og for det andet forholdet mellem stavformede calcium-tolerant at runde ikke-tolerante myocytes. Generelt dette protokol tager omkring 75-90 minutter fra hjertet fjernelse til myocyt yderklædningen og udbytter omkring 1 million stavformede cardiomyocytes (70-90% af den samlede myocytes høstet) fra en voksen mus hjerte. Dette kan variere med mu…

Discussion

For den bedste forberedelse, de mest kritiske trin er: 1) omgående at tilslutte musen hjerte til kanylen efter udskæring; 2) passende hjerte perfusion. Bemærk også, at vandkvalitet, perfusion temperatur, pH buffer, sterilisering, kemisk renhed, og ren, ikke-forurenet slanger og kamre er også vigtige faktorer. 18,2 MOhm molekylærbiologi-grade _H2O er stærkt anbefales til forberedelse buffer. PH-værdien af ​​200 mM ATP stamopløsning bør justeres til 7,2, et skridt, som er let at gå glip af.

Det er vigti…

Materials

Isolated heart system for small rodent	Harvard Apparatus	IHSR-mouse 73-4019
	Aortic Cannula, OD 1.0 mm	Harvard Apparatus	73-2816
Dumont #4 Forceps	Fine science tools	11294-00
Straight sharp serrated scissors	Fine science tools	14070-12
Serrated Graefe forceps	Fine science tools	11050-10
Curved, serrated Graefe forceps	Fine science tools	11052-10
Straight Mini Serrefines clamps	Fine science tools	18054-28
MEM	Gibco	11575-032
Collagenase II	Worthington	4176
Mucosal universal detergent	Sigma	Z637181	Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent.