Isolement et culture de cardiomyocytes adultes de souris pour Signalisation cellulaire et<em> In vitro</em> Hypertrophie cardiaque
Summary
Nous décrivons une méthode fiable pour l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes. Ce protocole donne un résultat cohérent pour la culture des cardiomyocytes adultes fonctionnels à partir d'une variété de souris génétiquement modifiées.
Abstract
Les progrès technologiques ont fait des souris génétiquement modifiées, y compris les souris transgéniques et knock-out de gène, un outil essentiel dans de nombreux domaines de recherche. Cardiomyocytes adultes sont largement acceptés comme un bon modèle pour la physiologie cellulaire cardiaque et la physiopathologie, ainsi que de l'intervention pharmaceutique. Les souris génétiquement modifiées interdisent la nécessité de processus d'infection des cardiomyocytes complexes pour générer le génotype désiré, qui sont inefficaces en raison de la différenciation terminale des cardiomyocytes. Isolement et culture de haute qualité et de quantité des cardiomyocytes fonctionnels seront considérablement profit de la recherche cardiovasculaire et de fournir un outil important pour la recherche sur la transduction de la signalisation cellulaire et le développement de médicaments. Ici, nous décrivons une méthode bien établie pour l'isolement des cardiomyocytes de souris adultes qui peuvent être mises en œuvre avec peu de formation. Le cœur de la souris est excisé et une canule à un système de cœur isolé, alors perfusé avec un sans calcium et de haute potassium tampon suivie par collagénase de type II digestion en mode perfusion rétrograde de Langendorff. Ce protocole donne un résultat uniforme pour la collecte des cardiomyocytes fonctionnels de souris adulte à partir d'une variété de souris génétiquement modifiées.
Introduction
Les cardiomyocytes sont pas proliférative. Il existe certaines lignées de cellules cardiomyocytes auriculaires, telles que HL-1 et les cellules AT-1 dérivées de tumeurs de souris atriaux; cependant, il n'y a pas de lignées cellulaires de cardiomyocytes ventriculaires adultes disponibles pour la recherche. Cultures de cellules primaires de cardiomyocytes de souris adultes fournissent un modèle puissant pour la recherche cardiaque au niveau cellulaire et moléculaire. À ce jour, ils ont été largement utilisés pour biochimique, physiologique et pharmacologique recherche 1. En outre, l'utilisation fréquente de souris génétiquement modifiées a nécessité des méthodes efficaces d'isolement des cardiomyocytes. Culture pure permet des conditions libres de l'interaction avec d'autres organes et la circulation systémique, par exemple par des facteurs neuro-hormonaux et hormone-like endogènes 2,3. Cependant, l'isolement de succès des cardiomyocytes peut être difficile.
Le protocole que nous présentons ici sont basées sur nos expériences avec cardiomyocyt de rat adultees et la méthode décrite par O'Connell et al 4,5. Surtout en 2007 5, ils ont décrit des techniques détaillées à partir de préparations de tampons à la culture de cellules et analyse fonctionnelle. Etant donné que les myocytes de souris sont très sensibles à la contracture par rapport aux cardiomyocytes de rats, des tampons ou des milieux utilisés pour la perfusion, la digestion, la Ca 2 + tolérance, le placage et la culture dans le protocole de la souris sont complétées avec un inhibiteur de couplage excitation-contraction non spécifique, 2, 3 Butanedione monoxime (BDM) pour inhiber leur contraction spontanée, donc la viabilité et le rendement des myocytes en forme de tige d'améliorer de manière significative. Dans le protocole présenté ici, les myocytes sont séparées dans un tampon à haute teneur en potassium du coeur isolé par perfusion de Langendorff modifié avec de la collagénase de type II. Collagénase II rompt effectivement vers le bas la matrice intercellulaire et cellules libère. La solution de perfusion conserve également le métabolisme cellulaire à un faible niveau 6. En additi, le système cardiaque isolé de Harvard Apparatus, nous avons utilisé ici est bien conçu pour une température précise et un contrôle permanent de la pression 7. Cette approche fournit des préparations hautement reproductibles et des populations uniformes de type cellulaire unique, qui peut être utilisé dans la culture pendant une nuit pour la mesure de protéines de signalisation ou de la culture de 2-3 jours pour les dosages hypertrophiques cardiaques.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pour la meilleure préparation, les étapes les plus importantes sont: 1) l'accrochage rapidement le cœur de la souris à la canule après l'excision; 2) la perfusion cardiaque approprié. Notez également que la qualité de l'eau, température de perfusion, le pH du tampon, la stérilisation, la pureté chimique, et propre, des tubes et des chambres non-contaminés sont également des facteurs importants. 18.2 mQ biologie moléculaire de qualité H 2 O est fortement recommandé pour la préparation de tampon. Le pH …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par National Heart, Lung, and Blood Institute Grant HL-36573. Nous remercions M. David Sowa pour l'édition de ce manuscrit.
Materials
| Isolated heart system for small rodent | Harvard Apparatus | IHSR-mouse 73-4019 | |
| Aortic Cannula, OD 1.0 mm | Harvard Apparatus | 73-2816 | |
| Dumont #4 Forceps | Fine science tools | 11294-00 | |
| Straight sharp serrated scissors | Fine science tools | 14070-12 | |
| Serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11050-10 | |
| Curved, serrated Graefe forceps | Fine science tools | 11052-10 | |
| Straight Mini Serrefines clamps | Fine science tools | 18054-28 | |
| MEM | Gibco | 11575-032 | |
| Collagenase II | Worthington | 4176 | |
| Mucosal universal detergent | Sigma | Z637181 | Mucasol is a fast alkaline residue-free detergent. |
Referências
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