Uma estratégia para sensíveis, Large Scale quantitativos Metabolomics

Resumo

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. Utilizando cromatografia normal em fases líquida acoplada à espectrometria de massa de alta resolução com mudança de polaridade e um ciclo rápido, nós descrevemos um protocolo para analisar a composição metabólica polar de material biológico com alta sensibilidade, precisão e resolução.

Resumo

Metabolite perfis tem sido um ativo valioso para o estudo do metabolismo na saúde e na doença. No entanto, as plataformas atuais têm diferentes fatores limitantes, como o trabalho intensivo preparações de amostra, baixos limites de detecção, velocidades de varredura lenta, otimização de método intensivo para cada metabólito, e a incapacidade de medir tanto positivamente e íons negativamente carregados em experiências individuais. Portanto, um protocolo de metabolômica novela poderia avançar estudos metabolômica. Cromatografia hidrófilo à base de amida permite análise de metabolitos polares sem qualquer transformação química. MS de alta resolução usando o Q-Exactive (QE-MS) melhorou óptica de íons, o aumento da velocidade de varredura (256 ms na resolução 70.000), e tem a capacidade de realizar comutação positivo / negativo. Usando uma estratégia de extracção de metanol frio, e o acoplamento de uma coluna de amida com QE-MS permite a detecção robusta de 168 metabolitos polares alvo e milhares de características adicionais simultaneamente. Datum tratamento é realizado com um software comercialmente disponível de uma maneira altamente eficiente, e características desconhecidas extraídos a partir dos espectros de massa pode ser consultado na base de dados.

Introdução

Metabolomics, definido como um ensaio que mede vários metabolitos simultaneamente, tem sido uma área de grande interesse. Metabolomics fornece uma leitura direta da fisiologia molecular e forneceu insights sobre o desenvolvimento e doenças como o câncer de ^1-4. Ressonância magnética nuclear (RMN) e cromatografia gasosa-espectrometria de massa (GC-MS) estão entre os mais utilizados instrumentos ^5-9. RMN, especialmente foi usado para experiências de fluxo desde que os compostos marcados de isótopos pesados, tais como ¹³ C metabolitos marcados, são RMN-activo ^10,11. No entanto, esta estratégia requer relativamente elevado grau....

Protocolo

1. Preparação de LC-MS Reagentes, Estabelecimento de um método de cromatografia, e estabelecimento de procedimentos operacionais de instrumentos

1. Preparação de solventes LC
   1. Prepare 500 ml fases móveis. A é acetato de amónio 20 mM e 15 mM de hidróxido de amónio em 3% de acetonitrilo / água, pH final de 9,0; e B é 100% de acetonitrilo.
   2. Vagamente tampar a garrafa, coloque-o em um banho de água sonicador e sonicate por 10 minutos sem aquecimento extra. (Este passo é o de assegurar que todos os sais de amónio e dissolver completamente que não há bolhas de ar residual.)
   3. Transferir 250 ml de solvente a uma garrafa de 250 ml de vidro pa....

Resultados

A precisão dos dados metabolômica altamente depende do desempenho do instrumento LC-QE-MS. Para avaliar se o instrumento está a funcionar em boas condições, e se o método aplicado é adequado, vários picos LC metabolitos conhecidos são extraídos a partir da cromatografia iónica total de (TIC), como mostrado na Figura 1. Metabolitos polares, incluindo aminoácidos, intermediários glicólise , intermediários de TCA, nucleótidos, vitaminas, ATP, ^NADPH e assim por diante têm uma boa retenção na colu.......

Discussão

Os passos mais críticos para perfilamento metabolito bem sucedida em células, utilizando este protocolo são: 1) o controlo do meio de crescimento e extracção cuidadosa das células; 2) ajustar o método de LC com base em MS configuração método para garantir que não são suficientes (geralmente pelo menos 10) pontos de dados em um pico para a quantificação; 3) fazer uma calibragem baixa massa antes de executar amostras; 4) a injecção de não mais do que 5 ml de evitar um tempo de retenção de deslocamento e alargamento do pic.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Mistura de calibração positiva	Thermo Scientific	#88323	É sensível à luz. Armazene a 4 ° C
Mistura de calibração negativa	Thermo Scientific	#88324	Armazenar a 4 ° C
Diazinon	Sant Cruz Biotecnologia	#C0413	Causa irritação nos olhos, então trabalhe com capuz. Armazene a 4 °
Inserção de agulha C H-ESI Fisher	Scientific	#1303200	Isso pode ser substituído ou limpo com 5% de ácido fórmico/água (remova o anel de borracha) se estiver entupido.
Coluna de amida Xbridge	Waters	#186004860	A coluna Guard é recomendada para aumentar a vida útil da coluna.