Juxtasomal biocytin Märkning för att studera struktur-funktions Förhållandet mellan individuella kortikala neuron
Summary
För att förstå strukturen av neuronala nätverk, är funktionella och morfologiska karakterisering av enskilda nervceller en nödvändighet. Här visar vi juxtasomal biocytin märkning, vilket gör att elektrofysiologiska inspelningar i den extracellulära konfiguration, men ändå behålla förmågan att intracellulärt märka neuron för post hoc rekonstruktion av dendritiska och axonal arkitektur.
Abstract
Hjärnbarken präglas av flera lager och många olika celltyper som tillsammans som ett nätverk är ansvariga för många högre kognitiva funktioner inklusive beslutsfattandet, sensorisk guidad beteende eller minne. För att förstå hur sådana intrikata neuronala nätverk utföra dessa uppgifter, är ett viktigt steg för att bestämma funktionen (eller elektrisk aktivitet) av enskilda celltyper inom nätverket, företrädesvis när djuret utför ett relevant kognitiv uppgift. Dessutom är det lika viktigt att bestämma den anatomiska strukturen i nätverket och den morfologiska strukturen för de enskilda nervceller att tillåta reverse engineering kortikala nätverk. Tekniska genombrott tillgängliga idag tillåter inspelning cellulär aktivitet i vaken, beter djur med värdefull möjlighet att i efterhand identifiera de inspelade nervceller. Här visar vi juxtasomal biocytin märkningsteknik, som innebär att inspelnings handling potentioal tillsatta i den extracellulära (eller lös-patch) konfiguration med hjälp av konventionella patch pipetter. Inspelning Konfigurationen juxtasomal är relativt stabil och tillämpas i beteende förhållanden, inklusive sövda, sövd, vakna huvud-fast, och även i den fritt rörliga djur. Således medger denna metod länka celltypsspecifik aktionspotential tillsatta under djurens beteende till återuppbyggnaden av de enskilda nervceller och slutligen, hela kortikala mikrokrets. I den här videon manuskript, visar vi hur enskilda nervceller i juxtasomal konfigurationen kan märkas med biocytin i uretan-nedsövd råtta för post hoc identifiering och morfologisk återuppbyggnad.
Introduction
Neuronala nätverk består av flera celltyper, som kännetecknas av mycket specifika morfologiska och fysiologiska egenskaper 1-7. Som en följd av enskilda celltyper utföra specialiserade uppgifter inom nätverket (se exempelvis GENTET et al. Åtta och Burgalossi et al. 9). Vi är bara i början för att förstå cell typspecifika funktioner över neuronala nätverk och mycket är fortfarande att bli upptäckt. För detta ändamål har många laboratorier genomföra experimentella metoder som möjliggör analys av morfologiska egenskaper hos samma neuronala populationen från vilken fysiologiska parametrar har erhållits 1,10-15. Här visar vi juxtasomal märkningsteknik 16,17 som involverar elektrofysiologiska inspelningar med användning av konventionella patch pipetter i den extracellulära (sålunda noninvasive)-konfigurationen i kombination med elektroporering av den inspelade neuron med biocytin. Denstor fördel med detta tillvägagångssätt är att icke-invasiv karaktär säkerställer att aktionspotentialens spiking av enskilda nervceller registreras utan att förändra (t ex dialys) det intracellulära innehållet i cellen. Följt av elektroporation ger juxtasomal strategi möjlighet att i efterhand cellidentifiering och återuppbyggnad för att länka funktion (fysiologi) till struktur (morfologi). Vanligtvis innebär morfologisk rekonstruktion rekonstruktion av dendritiska och axonal morfologi som kan utökas till kvantifiering av ryggraden och / eller Bouton densiteter eller rekonstruktion av neuronal morfologi vid nanometer upplösning med elektronmikroskopi. Den juxtasomal inspelningsteknik kan användas för in vivo-inspelningar av olika celltyper över kortikala skikt eller i under kortikala områden i en rad arter, även om de flesta studier har använt tekniken i små gnagare som möss eller råttor. Vår forskning är inriktad på att spela in och märkning nervcellerfrån råtta primära somatosensoriska cortex (S1) och innebär visuell identifiering av inspelade nervceller 18, till dendritiska rekonstruktioner i kombination med exakt registrering i en standardiserad referensramen dekonstruera kortikala nätverk 4,19 och detaljerad rekonstruktion av axonal arkitektur för att karakterisera celltyp specifika lokala och långväga projektion riktar 20.
Jämfört med alternativa in vivo inspelningsteknik (intracellulära eller hel-cell), juxtasomal inspelningar är relativt stabila och kan därför användas över beteende stater inklusive sövda 21,22, drogad 14, vaken huvud-fast 23, eller till och med fritt rörliga djur 9 . Här visar vi juxtasomal märkning i S1 av en uretan-sövd råtta, även om vi betonar den generella tillämpligheten av denna teknik för att många beredningar av val.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den juxtasomal metoden tillåter inspelning i vivo aktionspotential tillsatta från enstaka enheter över beteendemässiga förhållanden (sövda, vaken huvud-fast eller fritt rörliga) med möjlighet till biocytin-märkning den inspelade neuron för post hoc celltyp klassificering och / eller 3D-rekonstruktion. Den stora fördelen är att få fysiologiska parametrar i den extracellulära (alltså icke-invasiv) konfiguration, men ändå att kunna märka neuron intracellulärt med biocytin 16,17,32…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka Profs. Huibert Mansvelder och Bert Sakmann för omfattande stöd, Dr Marcel Oberlaender för givande diskussioner och ge neuronal spårning, och Brendan Lodder för tekniskt stöd. Data förvärvades med hjälp av ntrode VI för LabView, generöst tillhandahålls av R. Bruno (Columbia Univ.., NY, USA). Denna forskning stöds av Max Planck-sällskapet och Bernstein Center for Computational Neuroscience, Tübingen (finansierad av det tyska federala ministeriet för utbildning och forskning (BMBF; FKZ: 01GQ1002)) (RTN), Centrum för Neurogenomics och kognitiv forskning (CNCR) , neurovetenskap Campus Amsterdam (NCA), finansiering till CPJdK (NWO-ALW # 822.02.013 och ENC-nätverk # p3-c3) och VU University Amsterdam.
Materials
| SM-6 control system | Luigs & Neumann | ||
| LN- Mini 23 XYZ | |||
| LN- Mini 55 Manipulatorblock X2 | |||
| Lynx-8 amplifier | Neuralynx | ||
| Axoclamp-2B amplifier | Axon Instruments | ||
| Osada model EXL-M40 | Osada, inc. | ||
| Piezoelectric device | Physik Instrumente | PL140.10 | |
| Labview | National Instruments, Austin, TX, USA | ||
| Ntrode Virtual Instrument | R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA | ||
| (Labview acq. software) | |||
| Sugi absorbent swabs | Kettenbach | 30601 | |
| Cytochrome C from equine heart | Sigma | C2506 | |
| Catalase from bovine liver | Sigma | C9322 | |
| DAB | Sigma | D5637 | |
| H2O2 | Boom | 7047 | |
| Vectastain standard ABC-kit | Vector | PK6100 | |
| Triton X100 | Sigma | T9284 | |
| Urethane | Sigma | U2500 | |
| Isoflurane | Pharmachemie | 45.112.110 | |
| Lidocaine | Sigma | L5647 | |
| Simplex rapid dental cement | Kemdent | ACR308/ACR924 | |
| Biocytin | Molekula | 36219518 | |
| PFA | Merck Millipore | 8187151000 | |
| Trizma base | Sigma | T4661 | |
| Mowiol 4-88 | Aldrich | 81381 | |
| Analytical grade glycerol | Fluka | 49767 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| NaCl | Sigma Aldrich | 31434 | |
| KCl | Sigma Aldrich | 60130 | |
| CaCl | Sigma Aldrich | 22,350-6 | |
| MgCl2 | Fluka | 63072 |
Referências
- Brown, S. P., Hestrin, S. Cell-type identity: a key to unlocking the function of neocortical circuits. Curr. Opin. Neurobiol. 19 (4), 415-421 (2009).
- DeFelipe, J., et al. New insights into the classification and nomenclature of cortical GABAergic interneurons. Nat. Rev. Neurosci. 14 (3), 202-216 (2013).
- Dean, P., Porrill, J., Ekerot, C. F., Jorntell, H. The cerebellar microcircuit as an adaptive filter: experimental and computational evidence. Nat. Rev. Neurosci. 11 (1), 30-43 (2010).
- Oberlaender, M., et al. Cell type-specific three-dimensional structure of thalamocortical circuits in a column of rat vibrissal cortex. Cereb. Cortex. 22 (10), 2375-2391 (2012).
- Dyer, M. A., Cepko, C. L. Regulating proliferation during retinal development. Nat. Rev. Neurosci. 2 (5), 333-342 (2001).
- Klausberger, T., Somogyi, P. Neuronal diversity and temporal dynamics: the unity of hippocampal circuit operations. Science. 321 (5885), 53-57 (2008).
- Urban, N., Tripathy, S. Neuroscience: Circuits drive cell diversity. Nature. 488 (7411), 289-290 (2012).
- Gentet, L. J., et al. Unique functional properties of somatostatin-expressing GABAergic neurons in mouse barrel cortex. Nat. Neurosci. 15 (4), 607-612 (2012).
- Burgalossi, A., et al. Microcircuits of functionally identified neurons in the rat medial entorhinal cortex. Neuron. 70 (4), 773-786 (2011).
- Bock, D. D., et al. Network anatomy and in vivo physiology of visual cortical neurons. Nature. 471 (7337), 177-182 (2011).
- Briggman, K. L., Helmstaedter, M., Denk, W. Wiring specificity in the direction-selectivity circuit of the retina. Nature. 471 (7337), 183-188 (2011).
- Herfst, L., et al. Friction-based stabilization of juxtacellular recordings in freely moving rats. J. Neurophysiol. 108 (2), 697-707 (2012).
- Marx, M., Gunter, R. H., Hucko, W., Radnikow, G., Feldmeyer, D. Improved biocytin labeling and neuronal 3D reconstruction. Nat. Protoc. 7 (2), 394-407 (2012).
- Bruno, R. M., Sakmann, B. Cortex is driven by weak but synchronously active thalamocortical synapses. Science. 312 (5780), 1622-1627 (2006).
- Oberlaender, M., Ramirez, A., Bruno, R. M. Sensory experience restructures thalamocortical axons during adulthood. Neuron. 74 (4), 648-655 (2012).
- Joshi, S., Hawken, M. J. Loose-patch-juxtacellular recording in vivo-a method for functional characterization and labeling of neurons in macaque V1. J. Neurosci. Methods. 156 (1-2), 37-49 (2006).
- Pinault, D. A novel single-cell staining procedure performed in vivo under electrophysiological control: morpho-functional features of juxtacellularly labeled thalamic cells and other central neurons with biocytin or Neurobiotin. J. Neurosci. Methods. 65 (2), 113-136 (1996).
- de Kock, C. P., Bruno, R. M., Spors, H., Sakmann, B. Layer and cell type specific suprathreshold stimulus representation in primary somatosensory cortex. J. Physiol. 581 (1), 139-154 (2007).
- Egger, R., Narayanan, R. T., Helmstaedter, M., de Kock, C. P., Oberlaender, M. 3D reconstruction and standardization of the rat vibrissal cortex for precise registration of single neuron morphology. PLoS Comput. Biol. 8 (12), (2012).
- Oberlaender, M., et al. Three-dimensional axon morphologies of individual layer 5 neurons indicate cell type-specific intracortical pathways for whisker motion and. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (10), 4188-4193 (2011).
- Sakata, S., Harris, K. D. Laminar structure of spontaneous and sensory-evoked population activity in auditory cortex. Neuron. 64 (3), 404-418 (2009).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. High frequency action potential bursts (>or= 100 Hz) in L2/3 and L5B thick tufted neurons in anaesthetized and awake rat primary somatosensory cortex. J. Physiol. 586 (14), 3353-3364 (2008).
- de Kock, C. P., Sakmann, B. Spiking in primary somatosensory cortex during natural whisking in awake head-restrained rats is cell-type specific. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106 (38), 16446-16450 (2009).
- Wong-Riley, M. Changes in the visual system of monocularly sutured or enucleated cats demonstrable with cytochrome oxidase histochemistry. Brain Res. 171 (1), 11-28 (1979).
- Horikawa, K., Armstrong, W. E. A versatile means of intracellular labeling: injection of biocytin and its detection with avidin conjugates. J. Neurosci. Methods. 25 (1), 1-11 (1988).
- O’Connor, D. H., Peron, S. P., Huber, D., Svoboda, K. Neural activity in barrel cortex underlying vibrissa-based object localization in mice. Neuron. 67 (6), 1048-1061 (2010).
- Veinante, P., Deschenes, M. Single-cell study of motor cortex projections to the barrel field in rats. J. Comp. Neurol. 464 (1), 98-103 (2003).
- Boudewijns, Z. S., et al. Layer-specific high-frequency action potential spiking in the prefrontal cortex of awake rats. Front. Cell. Neurosci. 7, 99 (2013).
- Oberlaender, M., Bruno, R. M., Sakmann, B., Broser, P. J. Transmitted light brightfield mosaic microscopy for three-dimensional tracing of single neuron morphology. J. Biomed. Opt. 12 (6), 064029 (2007).
- Boudewijns, Z. S., et al. Semi-automated three-dimensional reconstructions of individual neurons reveal cell type-specific circuits in cortex. Commun. Integr. Biol. 4 (4), 486-488 (2011).
- Bruno, R. M., Hahn, T. T., Wallace, D. J., de Kock, C. P., Sakmann, B. Sensory experience alters specific branches of individual corticocortical axons during development. J. Neurosci. 29 (10), 3172-3181 (2009).
- Schubert, D. Observing without disturbing: how different cortical neuron classes represent tactile stimuli. J. Physiol. 581 (1), 5 (2007).
- Neumann, E., Kakorin, S., Toensing, K. Fundamentals of electroporative delivery of drugs and genes). Bioelectrochem. Bioenerg. 48 (1), 3-16 (1999).
- Haas, K., Sin, W. C., Javaherian, A., Li, Z., Cline, H. T. Single-cell electroporation for gene transfer in vivo. Neuron. 29 (3), 583-591 (2001).
