Juxtasomal Biocytin étiquetage pour étudier la structure-fonction de relation corticale individuelle neurones

Summary

Pour comprendre la structure des réseaux neuronaux, la caractérisation fonctionnelle et morphologique des neurones individuels est une nécessité. Ici, nous démontrons juxtasomal étiquetage biocytine, qui permet des enregistrements électrophysiologiques dans la configuration extracellulaire, tout en conservant la capacité d'étiqueter intracellulaire du neurone pour la reconstruction post-hoc de l'architecture dendritique et axonale.

Abstract

Le cortex cérébral est caractérisé par de multiples couches et de nombreux types cellulaires distincts qui, ensemble, en tant que réseau sont responsables de nombreuses fonctions cognitives supérieures, y compris la prise de décisions, le comportement sensori-guidée ou de la mémoire. Pour comprendre comment ces réseaux neuronaux complexes effectuer des tâches, une étape cruciale consiste à déterminer la fonction (ou l'activité électrique) de types de cellules individuelles au sein du réseau, de préférence lorsque l'animal exécute une tâche cognitive pertinente. En outre, il est également important de déterminer la structure anatomique du réseau et l'architecture morphologique des neurones individuels pour permettre l'ingénierie inverse du réseau cortical. Percées techniques disponibles aujourd'hui permettent d'enregistrer l'activité cellulaire en éveil, se comporter animaux avec l'option précieuse de post hoc identifier les neurones enregistrés. Ici, nous démontrons la technique de marquage juxtasomal de biocytine, qui implique l'action d'enregistrement potentiomètreal dopage dans le extracellulaire (ou loose-patch) configuration à l'aide de pipettes de patch classiques. La configuration de l'enregistrement de juxtasomal est relativement stable et applicables à l'ensemble des conditions de comportement, y compris anesthésiés, sédation, éveillé tête fixe, et même dans l'animal se déplacer librement. Ainsi, ce procédé permet d'associer un type de cellule spécifique dopage potentiel d'action au cours de comportement de l'animal à la reconstruction des neurones individuels et finalement, l'ensemble du microcircuit cortical. Dans cette vidéo, manuscrit, nous montrons comment les neurones individuels dans la configuration de juxtasomal peuvent être étiquetés avec biocytine chez le rat anesthésié uréthane pour l'identification et la reconstruction post-hoc morphologique.

Introduction

Les réseaux de neurones sont constitués de plusieurs types de cellules, caractérisé par les propriétés morphologiques et physiologiques très spécifiques ^7.1. En conséquence, les types de cellules individuelles des tâches spécialisées à l'intérieur du réseau (voir par exemple Gentet et al. ⁸ et Burgalossi et al. ^9). Nous commençons seulement à comprendre les fonctions spécifiques de type cellulaire à travers les réseaux neuronaux et beaucoup reste à découvrir. A cette fin, de nombreux laboratoires mettent en œuvre des approches expérimentales qui permettent l'analyse des propriétés morphologiques de la même population neuronale à partir de laquelle les paramètres physiologiques ont été obtenus ^1,10-15. Ici, nous démontrons la technique de marquage de juxtasomal ^16,17 qui implique des enregistrements électrophysiologiques en utilisant des pipettes de patch classiques dans la configuration extracellulaire (donc non invasif) en combinaison avec l'électroporation du neurone enregistré avec biocytine. Laavantage majeur de cette approche est que la nature non invasive permet de s'assurer que l'action de dopage potentiel de neurones individuels est enregistrée sans modifier (par exemple, la dialyse), la teneur intracellulaire de la cellule. Suivi par électroporation, l'approche de juxtasomal offre la possibilité d'identification et de reconstruction post-hoc cellule de lier la fonction (physiologie) à la structure (morphologie). Typiquement, la reconstruction comprend la reconstruction morphologique de morphologie dendritique et axonale qui peut être étendue à la quantification de la colonne vertébrale et / ou des densités Bouton ou encore la reconstruction de la morphologie neuronale à une résolution nanométrique en utilisant la microscopie électronique. La technique d'enregistrement de juxtasomal peut être utilisé pour des enregistrements in vivo de divers types de cellules à travers les couches corticales ou dans les zones sous-corticales dans une gamme d'espèces, bien que la plupart des études ont appliqué la technique dans les petits rongeurs tels que les souris ou les rats. Notre recherche se concentre sur l'enregistrement et l'étiquetage des neuronesde rat primaire cortex somatosensoriel (S1) et implique l'identification visuelle des neurones enregistrés ^18, reconstructions dendritiques en combinaison avec un enregistrement précis dans un cadre de référence normalisé de désosser réseaux corticaux ^4,19 et reconstruction détaillée de l'architecture axonale à caractériser locale spécifique du type de cellule et projection à long terme cible ^20.

Par rapport à vivo des techniques alternatives dans d'enregistrement (intracellulaires ou de cellules entières), les enregistrements juxtasomal sont relativement stables et peuvent donc être appliquées dans tous les États de comportement, y compris anesthésiés ^21,22, sédation ^14, éveillé animaux de la tête fixe ^23, ou même librement mobiles ⁹ . Ici, nous montrons l'étiquetage juxtasomal dans S1 d'un rat d'uréthane anesthésiés, mais nous insistons sur l'applicabilité générale de cette technique à de nombreuses préparations de choix.

Protocol

Une. Préparation de l'animal Toutes les procédures expérimentales sont menées en conformité avec la loi néerlandaise et après évaluation par un comité d'éthique local à l'Université VU d'Amsterdam, aux Pays-Bas. Anesthésier un rat Wistar (P25-P45, ♂ / ♀) avec de l'isoflurane (2-3% dans de l'oxygène) et ensuite avec de l'uréthane (20% dans 0,9% de NaCl, 1.6 à 1.7 g / kg) par injection intrapéritonéale. Évaluer la profondeur de l&#3…

Representative Results

La connaissance détaillée de la structure 3D de neurones individuels est cruciale pour élucider les principes d'organisation des réseaux de neurones. Notre méthode consiste à un pipeline pour atteindre la haute qualité de l'étiquetage biocytine partir d'une préparation in vivo, ce qui permet la classification neuronale après hoc et la reconstruction détaillée de l'architecture dendritique et axonale des neurones isolés à haute résolution. En fonction de la qualité de l&#…

Discussion

La méthode de juxtasomal permet d'enregistrer dans l'action in vivo dopage potentiel des unités simples dans des conditions de comportement (anesthésiés, éveillé tête fixe ou mobile librement) avec l'option de biocytine-étiquetage du neurone enregistré pour la classification post hoc de type cellulaire et / ou la reconstruction 3D. L'avantage majeur est d'obtenir des paramètres physiologiques de la configuration extracellulaire (donc non invasif), tout en étant c…

Materials

SM-6 control system	Luigs & Neumann
LN- Mini 23 XYZ
LN- Mini 55 Manipulatorblock X2
Lynx-8 amplifier	Neuralynx
Axoclamp-2B amplifier	Axon Instruments
Osada model EXL-M40	Osada, inc.
Piezoelectric device	Physik Instrumente	PL140.10
Labview	National Instruments, Austin, TX, USA
Ntrode Virtual Instrument	R. Bruno, Columbia Univ., NY, USA
(Labview acq. software)
Sugi absorbent swabs	Kettenbach	30601
Cytochrome C from equine heart	Sigma	C2506
Catalase from bovine liver	Sigma	C9322
DAB	Sigma	D5637
H2O2	Boom	7047
Vectastain standard ABC-kit	Vector	PK6100
Triton X100	Sigma	T9284
Urethane	Sigma	U2500
Isoflurane	Pharmachemie	45.112.110
Lidocaine	Sigma	L5647
Simplex rapid dental cement	Kemdent	ACR308/ACR924
Biocytin	Molekula	36219518
PFA	Merck Millipore	8187151000
Trizma base	Sigma	T4661
Mowiol 4-88	Aldrich	81381
Analytical grade glycerol	Fluka	49767
HEPES	Sigma	H3375
NaCl	Sigma Aldrich	31434
KCl	Sigma Aldrich	60130
CaCl	Sigma Aldrich	22,350-6
MgCl2	Fluka	63072