GABA 수용체 막 현지화 및 인신 매매를 연구하는 α-Bungarotoxin 바인딩 사이트 태그를 사용하여
Summary
여기에서 우리는 GABA 해마 신경 세포에있는 수용체 표면의 현지화 및 엔도 사이토 시스를 측정하기 위해-bungarotoxin을 α에 결합 형광 알렉사 염료의 사용을 보여줍니다. α-bungarotoxin, 세포막 단백질의 세포 내 이입 매매 분석을 달성 할 수있는 바인딩 짧은 세포 태그 베어링 구조의 사용을 통해.
Abstract
그것은 점점 더 분명 그 이온 성 GABA 수용체 (GABAAR), 전시 매우 역동적 인 인신 매매와 세포 표면의 이동성 1-7 등의 신경 전달 물질 수용체,. 수용체 세포 표면의 현지화 및 엔도 사이토 시스를 연구하기 위해, 여기에 설명 된 기술은 세포가 α-bungarotoxin (BGT) 결합 부위 (BBS)를 포함하는 구조를 표현하는 형광 α-bungarotoxin의 사용을 결합한다. BBS (WRYYESSLEPYPD)는 높은 친화력 8,9와 BGT를 결합하는 근육 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체의 α 서브 유닛을 기반으로합니다. BBS 사이트의 설립 이전에 GABAA 및 대사성 GABAB의 추적 2,10 수용체에 설명 된대로, 표면의 현지화 및 수용체의 삽입 또는 외인성 형광 BGT의 응용 프로그램 제거를 측정 할 수 있습니다. BBS 사이트 또, 아미노산 및 4 표준 m 의하여 성숙한 GABAAR 소단위의 (5) 사이에 pH 민감성 GFP (pHGFP 11)을 삽입olecular 생물학 및 PCR 클로닝 전략 12 (그림 1 참조). BBS는 13 아미노산 알라닌 / 프로 링커에 의해 분리 된 pH 민감성 GFP 기자의 3 '입니다. 총의 기자가 BGT 정상화 총 수용체 인구 수용체 인구를 표시하므로 GABAAR 소단위 단백질 수준을 태그로 고정 샘플을 기반으로이 책에서 설명한 연구 인신 매매의 경우, pHGFP는 역할을한다. 이것은 태그 GABAAR 소단위의 높거나 낮은 기준선 식의 결과 BGT 염색 신호 가변성 세포 간을 최소화한다. 또한 pHGFP 태그 라이브 또는 고정 이미징 실험을위한 구조 발현하는 세포를 쉽게 식별 할 수 있습니다.
Introduction
의 형광 수용체 현지화 및 역학을 연구하는 α-bungarotoxin을 결합 사용은 니코틴 성 아세틸 콜린 수용체 13-15, 독소의 내생 대상의 연구에서 개척되었다. 그 후, 최소한의 BGT 바인딩 펩타이드 (BBS)의 결합은 두 흥분성과 억제 리간드 게이트 이온 채널 및 G 단백질 결합 수용체 2,10,16-21의 인신 매매를 연구하는 데 사용되었습니다. 이 BBS 기반 기술은 표면의 바이오 티 닐화 방법, 세포 항원에 대한 항체와 살아있는 세포의 항체 라벨 및 (FRAP)을 photobleaching에 후 형광 복구와 같은 인신 매매의 연구에 사용되는 다른 방법에 이점을 제공한다. 세포 표면 동안 바이오 티 닐화 무료 아민이 공유 결합으로 세포 활동에 영향을 미칠 가능성과 함께 수정됩니다. 항체 기반의 연구는 종종 인신 매매 이벤트를 변경할 수있는 표면 항원의 클러스터링이나 모자를 씌우기에 의해 방해되었다. 때문에 FRAP들에 대한 표백 단계에tudies, 중요한 문제는 기본 세포 구조를 손상된다. 추가적인 장점은 BBS는 구조도 바이오틴 결합 엉덩이에 bungarotoxin 수용체 인신 매매와 생화학 적 방법에 사용할 수있는 태그입니다. 이 기술은 세포주 및 일차 전지가 쉽게 적용 가능하다. 표시된 바와 같이 니코틴 아세틸 콜린 (nAChR의) 수용체를 발현하는 세포에 사용하기위한, nAChR의 길항제 tubocurarine는 프로토콜에서 사용되어야한다. tubocurarine의 부재에 형질 감염되지 않은 세포 (엔도 시토 시스 프로토콜 T = 0 시점에 해당) 간단한 표면 BGT 라벨을 수행하면 내생 nAChR의 증거를 제공 할 것입니다.
그것은 또한 단백질이 세포막에 전달되는 세포의 위치에 존재하도록 이러한 기술을 사용하기위한 중요한 고려 사항은 BBS의 적절한 삽입이다. 예를 들어, GABAAR 서브 유닛의 N-말단 도메인은 인신 동안 기공을 갖는 루멘에 상주ficking 및 세포 표면 수용체와 세포 내 이입에 의해 이벤트가 세포 표면에서 그들의 제거의 평가의 구체적인 표시를 허용 세포막에있는 수용체 삽입 후 세포가된다. 우리는 이전에 GFP, MYC, 또는 BBS의 추가 GABAAR 서브 유닛이 도메인에 항원 것으로 나타났습니다 것은 기능적으로 침묵이다. 표준 컨트롤은 적절 지역화 것을 태그로 단백질을 구성하는 태그없는 유사한 수준으로 발현 될 수 있도록 수행되고, 그것은 수용체 기능에 영향을주지해야한다. 형질 구조의이 특성은 문제 해결의 과발현 문제에 도움이됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 설명 BBS 기반 고정 라이브 기법 수용체 또는 세포주, 뉴런, 및 다른 프라이 머리 셀의 다른 세포막 단백질 매매를 추적하기 위해 사용될 수있다. 이 방법은 성공적 막 삽입 및 리간드 관문 이온 채널과 GPCR의 제거를 연구 인해 수용체 작용제 및 조절제의 존재로 매매의 변화를 평가하기 위해 사용되었다. 주요 측면은 적절한 세포 위치 태그의 현지화 및 BBS의 추가를 확인하기 위해 컨트롤을 …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
지원은 의학의 피츠버그 대학의 학교에서 약리학 및 화학 생물학과에서 시작 – 기금에 의해 제공되었다. 니콜라스 그라프 : 비디오 제출에 기여 야곱 실험실 구성원의 확인.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| P3 Primary Cell 4D kit | Lonza | V4XP-3024 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 647 conjugate | Molecular Probes | B35450 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 488 conjugate | Molecular Probes | B13422 | |
| α-bungarotoxin, Alexa Fluor 594 conjugate | Molecular Probes | B13423 | |
| (+)-Tubocurarine chloride | Tocris | 2820 | |
| mounting medium | DAKO | cS703 | |
| DPBS no calcium,magnesium | Invitrogen | 14190-136 | |
| poly-D-lysine | Sigma | P6407 | |
| gephyrin antibody | Synaptic Systems | 147 011 | 1:300 |
| VIAAT/VGAT antibody | Synaptic Systems | 131 002 | 1:1000 |
| anti GFP | Life Technologies | A6455 | 1:2000 |
| glass bottom tissue culture dish | MatTek Corporation | P35G-1.5-14-C – Mattek Dishes | |
| coverslips (round cover glass), #1 thickness, 12 mm | Warner Instruments | 640-0702 | |
Referências
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