La cornée micropoche test: Un modèle de l'angiogenèse dans l'oeil de la souris
Summary
Le protocole décrit l'essai de micropoche de la cornée tel que développé chez la souris.
Abstract
L'essai de micropoche de la cornée de la souris est un test robuste et quantitative in vivo pour l'évaluation de l'angiogenèse. En utilisant des pastilles standardisés à libération lente contenant des facteurs de croissance spécifiques qui déclenchent la croissance des vaisseaux sanguins tout au long de la cornée naturelle avasculaire, l'angiogenèse peut être mesurée et quantifiée. Dans cet essai, la réponse angiogénique est généré au cours de plusieurs jours, selon le type et la dose de facteurs de croissance utilisé. L'induction de la néovascularisation est généralement déclenchée soit par le facteur de croissance basique des fibroblastes (bFGF) ou un facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF). La combinaison de ces facteurs de croissance avec le sucralfate et hydron (poly-HEMA (poly (méthacrylate de 2-hydroxyéthyle))) et couler le mélange en pastilles, ils peuvent être implantés chirurgicalement dans l'oeil de la souris. Ces pastilles uniformes libèrent lentement les facteurs de croissance au cours de cinq ou six jours (bFGF ou VEGF respectivement) permettant réponse angiogénique suffisant requis pour la zone de la cuve qUANTIFICATION en utilisant une lampe à fente. Ce dosage peut être utilisé pour différentes applications, y compris l'évaluation de médicaments modulateurs angiogéniques ou des traitements, ainsi que la comparaison entre les différents fonds génétiques qui affectent l'angiogénèse. Un enquêteur qualifié après avoir pratiqué ce test peut implanter une pastille en moins de 5 minutes par œil.
Introduction
Le processus de l'angiogenèse, la formation de nouveaux vaisseaux sanguins se forment des préexistants, est très complexe et est régulée par plusieurs facteurs endogènes qui contrôlent les différentes étapes de la germination et de la morphogenèse de la cuve. L'angiogenèse est déclenchée en raison d'un changement dans l'équilibre entre les facteurs pro et anti-angiogéniques, un équilibre qui maintient normalement le système vasculaire dans un état de repos. L'angiogenèse se produit chez l'adulte dans certaines conditions physiologiques, tels que au cours du cycle ovarien femelle ou dans les processus de réparation tels que la cicatrisation des plaies et la régénération des tissus. Cependant, il est également une caractéristique de nombreuses pathologies, notamment les tumeurs malignes, les conditions auto-immunes et des maladies inflammatoires. L'implication de l'angiogenèse dans les conditions physiologiques et pathologiques, il est un important sujet de recherche et une cible intéressante pour une thérapie.
En raison de la complexité de l'angiogenèse et de l'implication de plusieurs CElls et les facteurs dans le processus, y compris les cellules endothéliales, les péricytes, cellules circulantes et les cellules stromales, des modèles in vitro restent limitées et ne peuvent pas récapituler le microenvironnement in vivo unique. Le principal des essais in vitro de l'angiogenèse sont en grande partie axées sur l'observation des effets directs sur les cellules endothéliales et de mesurer certaines étapes du processus angiogénique dans des conditions contrôlées. Ces analyses comprennent la quantification des cellules endothéliales prolifération une migration 2, la formation du réseau 3, formation du tube 4 et la germination de sphéroïdes 5. Modèles ex vivo, contrairement à celles in vitro, sont plus complexes et intégrer de multiples types de cellules des tissus, un exemple étant le test de l'anneau aortique 6. Néanmoins, comme d'autres systèmes, on ne peut pas capturer la contribution de cellules circulantes du stroma et des cellules endothéliales naturel que celui qui existe in vivo. Tentativespour étudier l'angiogenèse sous flux d'imiter la mise en vivo sont réalisés en utilisant des systèmes microfluidiques 7, mais même ces tests, bien que beaucoup sont améliorées, sont encore incapables de rendre compte de tous les compartiments existants in vivo.
En raison des limitations de l'in vitro et ex vivo de l'angiogenèse des modèles, des modèles in vivo restent les plus fiables de choix pour l'étude de l'angiogenèse. Des exemples de ces modèles comprennent l'implantation des chambres transparentes, des «fenêtres», qui permettent la visualisation des vaisseaux sanguins en croissance sous microscope 8, implants sous-cutanés injectables tels que matrigel et récipient formation dans les tissus normaux tels que l'oreille de la souris et la membrane chorio-allantoïde de poulet (CAM ). Cependant, l'un des modèles les plus acceptables et quantitatives in vivo l'angiogenèse est l'essai de micropoche de néovascularisation de la cornée est décrit ici, qui exploite le naturellement avasculairecornée comme un «écran» de visualiser et d'évaluer une nouvelle croissance angiogénique 9.
Nous décrivons ici le test de micropoche cornéen développé chez la souris. Initialement, le modèle a été utilisé pour mesurer des stimuli angiogéniques non spécifiques dans les cornées de lapin. Cela a été fait par introduction des morceaux de tumeur dans l'humeur aqueuse de la chambre antérieure de l'œil de lapin et de mesurer la néovascularisation induite par une tumeur 11.
Cependant, l'essai a été plus tard évolué pour étudier les effets de croissance spécifique des facteurs 10 de mieux préciser et normaliser l'effet angiogénique. Afin de libérer le facteur de croissance de l'œil, des granulés à libération lente contenant des quantités connues de facteurs de croissance angiogéniques ont été utilisés à la place des tissus. La disponibilité de protéines angiogéniques recombinants purifiés tels que bFGF ou VEGF a permis leur utilisation comme objectifs spécifiques de modulaters de l'angiogenèse 12. Dans un premier temps, le dosage étaitlargement utilisé chez les lapins, qui sont plus faciles à travailler en raison de leur taille, mais plus tard, le modèle a été traduit dans des souris; un modèle animal plus petit et moins coûteux. Le passage de lapin à la souris fournit un avantage important d'être en mesure d'utiliser des animaux génétiquement modifiés, créant ainsi un nouveau domaine de recherche sur les composantes génétiques qui influent angiogenèse 13. En plus de l'utilisation plus acceptable de dosage de cornée dans l'étude de l'angiogenèse, d'autres processus biologiques peuvent également être étudiées en utilisant des tests modifiés. Par exemple, des études de la lymphangiogenèse ont été rendues possibles grâce à l'implantation de pastilles à faible dose bFGF qui a permis la visualisation des vaisseaux lymphatiques par marqueurs moléculaires spécifiques 14. En outre, cet essai a fourni un moyen pour évaluer les effets du rayonnement sur l'angiogenèse 15.
En résumé, l'analyse de l'angiogenèse de la cornée micropoche est une quantitative, représentantroducible, évaluation souple de l'angiogenèse in vivo. Un avantage majeur de cette analyse est que le jaugeage des bateaux de fond n'est pas nécessaire parce que les vaisseaux se développent sur un tissu naturellement avasculaire. Nous décrivons ici le protocole de cet essai dans les détails et discuter de différents scénarios qui peuvent se produire. Le test se compose de 3 segments distincts. Ici, nous allons décrire la préparation de pastilles de facteur compris la croissance, l'implantation chirurgicale ultérieure, et finalement la méthode utilisée pour quantifier la croissance néovasculaire résultant.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il ya plusieurs étapes critiques dans la réalisation d'une analyse de la cornée réussie. La première consiste à créer des pastilles uniformes susceptibles d'être implanté et en stimulant les vaisseaux. Les parties les plus importantes de la préparation de granulés sont 1) en utilisant le facteur de croissance sans support; 2) assurer un bon mélange de facteur de croissance avec le sucralfate et hydron et 3) le déplacement du mélange final rapidement mais avec précaution du tube Eppendorf à la mai…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Kristin Johnson pour le travail graphique.
Materials
| Section 1: Pellet preparation | |||
| Sucralfate | Sigma | #S0652 | |
| Hydron (aka Poly(2-Hema)) | Sigma | #P3932-10G | |
| Ethanol | Pharmco Products Inc | #111000200CSGL | |
| Growth factors: | Must be carrier-free (no bovine serum albumin(BSA)) | ||
| Fibroblast growth factor (FGF) | PeproTech | #AF-100-18B | |
| Vascular endothelial growth factor (VEGF) | R & D Systems | #293-VE-050/CF | |
| 35 mm dish | Becton-Dickson | #353001 | Used for storage of pellets |
| 10 cm petri dish | VWR | #25384-342 | Used as work surface for preparing pellets |
| Mesh | Sefar America | #03–300/51 | 300 um nitex nylon, cut into cm square pieces and sterilzed in autoclave |
| Spatulas | Fisher Scientific | #21-401-10 | Use tapered end of one to break up pellet mixture. Bend tapered end of other to help remove mixture from microcentrifuge tube. |
| Microcentrifuge tubes | Fisher Scientific | #05-408-146 | One for hydron, one for sucralfate |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2315E | Need 2 for pulling mesh apart |
| Centrifugal evaporator | ThermoSavant | DNA110 SpeedVac | |
| Section 2: Surgical implantation of pellets | |||
| Operating microscope | Zeiss | ||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Proparacaine hydrochloride ophthalmic solution 0.5% | Falcon | NDC# 6131401601 | Eye anesthetic |
| Triple Antibiotic Ophthalmic Ointment | Bausch & Lomb | NDC# 2420878055 | Contains neomycin, polymixin and bacitracin |
| Ophthalmic microknife, 5 mm | Surgistar | #924501 | 30 degree angle |
| von Graef knife | Ambler Surgical | #3401E | |
| Jewelers forceps, #1 | Ambler Surgical | #2301E | Must be blunted with sharpening stone for proptosing eye |
| Jewelers forceps, #5 | Ambler Surgical | #2305E | For picking up pellets and placing on eye |
| Small curved scissors | Ambler Surgical | #5636E | For trimming whiskers |
| Gauze | For blotting eye after proparacaine | ||
| Section 3: Grading of Corneal Neovascularization | |||
| 2.5% Avertin | General anesthetic | ||
| Slit lamp | Nikon | FS-2 | Needs an ocular with a reticule to assist in measuring |
Referências
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