Bio-lags Interferometry til måling Kinetik af protein-protein interaktioner og allosteriske Ligand Effects
Summary
Protokollerne her beskriver kinetiske analyser af protein-protein interaktioner med Bio-lags Interferometry. F-typen ATP syntase, som er involveret i cellulære energi metabolisme, kan hæmmes af sin ε underenhed i bakterier. Vi har tilpasset Bio-lags interferometri at studere interaktioner af det katalytiske kompleks med ε hæmmende C-terminale domæne.
Abstract
Vi beskriver brugen af Bio-lags Interferometry at studere hæmmende interaktioner af subunit ε med den katalytiske kompleks af Escherichia coli ATP syntase. Bakteriel F-typen ATP syntase er målet for en ny, FDA-godkendt antibiotika til bekæmpelse af multiresistent tuberkulose. Forståelse bakterie-specifikke auto-hæmning af ATP syntase ved C-terminale domæne af subunit ε kunne give en ny måde at målrette den enzym til opdagelsen af antibakterielle stoffer. Den C-terminale domæne af ε gennemgår en dramatisk konformationsændring når enzymet overgange mellem aktive og inaktive stater og katalytisk-site ligander kan påvirke, hvilke af ε s konformationer er fremherskende. The assay måler kinetik ε bindingssted / dissociation med det katalytiske kompleks og indirekte MEAninger skiftet enzym-bundet ε til og fra tilsyneladende nondissociable inhiberende konformation. Bio-lag interferometri signal er ikke overdrevent følsom over for opløsning sammensætning, så det også kan bruges til at overvåge allosteriske virkninger af katalytisk-site ligander på ε er konformationelle ændringer.
Introduction
Protein-protein interaktioner er vigtige for mange biologiske processer og etiket-fri optiske metoder som overflade plasmon resonans (SPR) er blevet anvendt in vitro for at undersøge kinetikken for binding og dissociation 1. De fleste label-fri metoder immobilisere et biomolekyle på en overflade og bruge en optisk signal til at opdage en bindende partner fra løsning, da det forbinder med det immobiliserede biomolekyle 1.. Mens SPR er en yderst følsom metode, det er udsat for interferens som følge af ændringer i brydningsindeks af opløsningen strømmer over sensor 2. Selvom det ikke er så følsomt som SPR, Bio-lags Interferometry (BLI) er mindre påvirket af ændringer i prøven sammensætning 1,3. BLI bruger fiberoptiske biosensorer, der har en proprietær biokompatibel belægning på spidsen. Det system, der anvendes her (Oktet-RED96) indeholder otte spektrofotometre. Hvidt lys ledes til en række af sonder, der bevæger sig på en robotarm. Fiberoptiske sensorer are opfanget af proberne og flyttes til en 96-brønds plade indeholdende prøver. En af målmolekylerne er immobiliseret på biosensoroverfladen. Derefter sensorer flyttes til brønde indeholdende bindingspartneren i opløsning. BLI overvåger sammenslutning af den bindende partner med det immobiliserede molekyle, og derefter overvåger dissociation efter at flytte sensorerne til løsning uden bindende partner. Binding af molekyler til biosensoroverfladen fører til ændringer i optisk interferens mellem lysbølger, der afspejler tilbage til spektrofotometre fra en indre overflade og fra den eksterne grænseflade mellem sensor og løsning. Disse ændringer i interferens kan kvantificeres og anvendes til at bestemme kinetiske satser for binding og dissociation, som opsummeret i animationen af figur 1.
Vi har anvendt BLI at måle interaktioner mellem det katalytiske kompleks af bakteriel ATP syntase og ε-underenhed, som automatisk kan inhibere enzymet. ATP SYnthase er en membran-embedded roterende nanomotor som katalyserer syntese og hydrolyse af ATP 4. Det katalytiske kompleks (F 1), kan isoleres i en opløselig form, der fungerer som en ATPase. Subunit ε har to domæner: N-terminal domæne (NTD) er nødvendig for korrekt samling og funktionelle kobling af enzymet, men ikke interagerer direkte med de katalytiske underenheder, det C-terminale domæne (CTD) kan hæmme enzymet ved at interagere med flere katalytiske underenheder 5,6. Denne ε-medieret regulering er specifik for bakterielle ATP synthaser og er ikke observeret i mitokondrie homolog. ATP syntase er opstået som et mål for antibakterielle stoffer, som det fremgår af den seneste FDA godkendelse af bedaquiline at behandle multiresistent tuberkulose 7. Således kunne målrette ε hæmmende rolle for lægemiddelforskning give antibakterielle midler, der ikke hæmmer mitokondrie ATP syntase. Med det isolerede katalytiske kompleks (F 1), εbliver et dissocierbart underenhed. Men med ε bundet til F 1 kan εCTD undergå en dramatisk konformationsændring, delvist indsættelse i enzymets centralt hulrum, og som danner en inhibitorisk stat, der er usandsynligt, at dissociere direkte 6,8. Vi bruger BLI at måle kinetik F 1 / ε bindende og dissociation, og indirekte, at undersøge allosteriske effekter af katalytisk-site ligander på ε s kropsbygning.
I vores system ε blev valgt til immobilisering på sensoroverfladen siden BLI signal (som SPR) er følsom over for massen af molekylerne binder på overfladen. Den ε underenheden er små (~ 15 kDa) i forhold til den vigtigste F 1 kompleks (~ 347 kDa). Således vil et større BLI signal skyldes binding af F 1 til immobiliseret ε. For at overvåge F 1 dissociation, hvilket kan være meget langsom, skal ε kraftigt immobiliseret. Således valgte vi at biotinylereOg immobilisere det på streptavidin-coatede biosensorer. Proteiner kan biotinyleres ved (i) tilfældig modifikation af overflade lysiner 9, (ii) omsætning af en unik nativt eller manipuleret cystein med en biotin-maleimid reagens 10 eller (iii) genetisk tilføje en specifik biotin-acceptor-peptid, der er enzymatisk biotinyleres under in vivo-ekspression af det kodede protein 11. I vores system er ε biotinyleres under anvendelse af metode (iii) 8. Når biotin-mærkede ε er immobiliseret på streptavidin sensorer kan BLI måle bindingen og dissociation af F 1, der er blevet tømt for underenhed ε (F 1 (-ε)). For eksperimenterne beskrevet her var foreløbige analyser blevet gjort for at bestemme rimelige mængder af det biotinylerede protein til immobilisering på sensorerne. Dette kan variere afhængigt af molekylvægten af proteinet og dets bindingspartner, men målet er at bestemme en minimal mængde af immobiliseret protein that giver (I) acceptabelt signal til støj for binding kinetik med en lav koncentration af bindingspartneren (under K D) og (ii) minimal forvrængning af binding kinetik med nær-mættende koncentration af bindingspartneren. Desuden kan støkiometri biotinylering variere (men undgå> 1 mol biotin / mol protein), så nogle indledende analyse kan være behov for hvert nyt lot biotinyleret protein for at bekræfte, at en konsekvent BLI signal kan opnås i løbet af immobilisering på streptavidin-coatede sensorer.
Protocol
Representative Results
Discussion
Eksisterende instrumenter til BLI tillade betydelig gennemløb og fleksibilitet i assays for biomolekylære interaktioner. Forskellige opløsning prøver dispenseres i brønde i en sort mikrotiterplade, og et sæt af parallelle BLI sensorer er programmeret til at bevæge sig frem og tilbage mellem søjler af brønde på pladen. Prøverne omrøres med orbital omrystning hele assayet. Systemet anvendes her har 8 sensorer og bruger en 96-brønds prøveplade, men et andet system bruger 16 sensorer og en 384-brønds prøvepl…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker FortéBio til at tilvejebringe grafik, der anvendes i figur 1. Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud GM083088 til TMD
Materials
| Octet-RED96 | Pall/FortéBio | 30-5048 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A6003-10G | Fatty Acid free |
| Biosensor/Streptavidin | Pall/FortéBio | 18-5019 | Tray of 96 sensors |
| Microtiter plate | Greiner Bio-one | 655209 | Black, Polypropylene |
| Data Acquisition software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
| Data Analysis software | Pall/FortéBio | Version 6.4 | Newer versions available |
Referências
- Nirschl, M., Reuter, F., Voros, J. Review of Transducer Principles for Label-Free Biomolecular Interaction Analysis. Biosensors. 1, 70-92 (2011).
- Homola, J. Present and future of surface plasmon resonance biosensors. Anal. Bioanal. Chem. 377, 528-539 (2003).
- Piehler, J., Brecht, A., Gauglitz, G. Affinity Detection of Low Molecular Weight Analytes. Anal. Chem. 68, 139-143 (1996).
- Duncan, T. M., Hackney, D. D., Tamanoi, F. The Enzymes. Energy Coupling and Molecular Motors Vol. XXIII, 203-275 (2004).
- Feniouk, B. A., Suzuki, T., Yoshida, M. The role of subunit ε in the catalysis and regulation of FOF1-ATP synthase. Biochim. Biophys. Acta. 1757, 326-338 (2006).
- Cingolani, G., Duncan, T. M. Structure of the ATP synthase catalytic complex (F1) from Escherichia coli in an autoinhibited conformation. Nat. Struc. Mol. Biol. 18, 701-707 (2011).
- Mirsaeidi, M. After 40 years, new medicine for combating TB. Int. J. Mycobacteriol. 2, 1-2 (2013).
- Shah, N. B., Hutcheon, M. L., Haarer, B. K., Duncan, T. M. F1-ATPase of Escherichia coli: The ϵ-inhibited state forms after ATP hydrolysis, is distinct from the ADP-inhibited state, and responds dynamically to catalytic site ligands. J. Biol. Chem. 288, 9383-9395 (2013).
- Burgess, T. L., Ross, S. L., Qian, Y. -. x., Brankow, D., Hu, S. Biosynthetic Processing of neu Differentiation Factor: glycosylation, trafficking, and regulated cleavage from the cell surface. J. Biol. Chem. 270, 19188-19196 (1995).
- Loo, T. W., Clarke, D. M. Membrane Topology of a Cysteine-less Mutant of Human P-glycoprotein. J. Biol. Chem. 270, 843-848 (1995).
- Tsao, K. -. L., DeBarbieri, B., Michel, H., Waugh, D. S. A versatile plasmid expression vector for the production of biotinylated proteins by site-specific, enzymatic modification in Escherichia coli. Gene. 169, 59-64 (1996).
- Dayne, D. BioLayer Interferometry (BLI) – How Does it Work?. FortéBio newsletter In Interactions. 5, 8-9 (2012).
- Wartchow, C., et al. Biosensor-based small molecule fragment screening with biolayer interferometry. J. Comput. Aided Mol. Des. 25, 669-676 (2011).
- Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor, the Octet. Anal. Biochem. 377, 209-217 (2008).
