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Química

뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 - 합성에서 생화학 적 특성에

Published: April 03, 2014
doi:
10.3791/51385
, ,
1Department of Chemistry and Biochemistry,University of Bern

Summary

여기에 설명 된 프로토콜은 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트로 이어지는 복잡한 경로의 방법으로 다양한 장애물을 설명하고 요약하다하는 것을 목표로하고있다. 따라서,이 프로토콜은 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 합성과 실제 응용 프로그램의 가용성 모두를 용이하게합니다.

Abstract

화학 작용기의 도입을위한 전통적인 전략은 초기 체인 적절히 변경됨 포스 전구체를 추가하여 고상 합성을 사용하는 것이다. 그러나 오히려 짧은 시퀀스 합성 중에 사용 제한 조건이 방법론의 적용을 방해. 한편, 변형 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트는 핵산, 실제 응용의 광범위한 팔레트 변경됨 핵산의 사용을 위해 도로를 포장 전략으로 수많은 작용기 마일드 도입에 이용 된 빌딩 블록을 활성화 이러한 리보 자임하고 DNAzymes의 기능 태그 및 생성 등. 주요 과제 중 하나는 이러한 뉴 클레오 시드 유사체의 분리 및 특성에 이르는 방법론의 복잡함에 있습니다.

이 비디오 문서에서는, 우리는 살전의 합성에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다전자 인 (III) 기반의 시약을 사용하여 유사체를 수정했습니다. 또, 생화학 적 특성 규명을위한 절차는 프라이머 신장 반응 및 TDT 테일링 중합에 중점으로, 누설된다. 이 상세한 프로토콜은 수정의 dNTPs 크래프트 조합 및 화학 생물학에서의 추가 사용을위한 사용이 될 것입니다.

Introduction

5'-뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 ((D) NTPS)는 에너지의 보편적 인 통화되는 세포 물질 대사의 규제에 이르기까지 수많은 프로세스와 기능에 관련된 중요한 생체 분자의 종류를 나타냅니다. 이러한 기본적인 생물학적 변환에서의 역할뿐만 아니라, 자신의 수정 된 대응은 올리고 뉴클레오티드에 작용기의 도입에 대한 다양하고 가벼운 플랫폼, 잘 일반적으로 1,2 적용되는 자동화 된 고체상 합성을 보완하는 방법으로 전진했다. 사실, (D) NTPS은 RNA와 DNA 중합 효소 3 기판, 아미노산 4-13, 보론 산 14, 15, nornbornene 16, 다이아 몬도와 같은 잔류 17 일에 대한 사이드 체인 등의 기능 그룹의 풍부한 역할을 할 수 제공 organocatalysis 18 담즙산 19, 심지어 올리고 뉴클레오티드 (20)는 올리고 뉴클레오티드에 도입 될 수있다.

_content "> 핵산의 작용에 편리한 벡터를 나타내는 외에도, 수정의 dNTPs는 SELEX 및 수정 된 촉매 핵산 21-30과 다양한 실제 응용 프로그램 (10)에 대한 압 타머의 생성을위한 체외 선택 기타 관련 조합 방법에 종사 할 수있다 31-36. 수정의 dNTPs의 중합에 의해 도입 된 추가 사이드 체인은 선택의 실험 기간 동안 탐험 핵산 (37)의 다소 빈약 한 기능의 무기고를 보충 할 수있는 화학 물질 공간을 늘릴 생각된다. 그러나 이러한에도 불구하고 매력적인 특성과 합성 및 분석 방법 모두의 개발에서 만든 최근의 진보, 보편적으로 적용 가능하고 높은 항복 절차는 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 2.38의 씁니다 존재합니다.

이 의정서의 목적은 (때로는) 복잡한 절차 선도 t으로 빛을 발산하는 것입니다오 합성이 활성화 빌딩 블록 (그림 1B)의 생화학 적 특성. 특별한 강조가 종종 발견하기 어려운 또는 실험 섹션에 존재하지만 순수한 (D) NTPS의 분리 (그림 1)에 이르는 합성 경로의 성공적인 완료에 아직 중요한 모든 합성 세부 사항에 대해 설명하기로한다.

Protocol

1. 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트의 합성 선택의 합성 방법은이 방법은 일반적으로 신뢰성이 매우 몇 가지 측면 제품 (그림 1A) 39 리드 이후 루드비히와 에크 스테인에 의해 개발 된 절차를 따릅니다. 회 무수 피리딘 (2 ml)로하고, 밤새 진공 하에서 건조 후 적절 3'-OAC 보호 된 뉴 클레오 시드 (전형적 0.1 밀리몰)으로 공 증발. 동시에, …

Representative Results

그들은 핵산 (41)에 작용기의 광대 한 배열의 손쉬운 도입을 허용 이후 수정 된 뉴 클레오 사이드 트리 포스페이트 합성 목표를 매혹됩니다. 그러나, 이러한 활성화 된 빌딩 블록의 분리 및 특성 규명은 종종 힘든 것으로 밝혀진다. 따라서, 여기에 기술 된 결과를 상기 합성, 생화학 적 절차 (그림 1B) 내에서 여러 단계를 수행하기 위해 도움의 손길을 제공 할 것으로 생각된다. </…

Discussion

핵산에 수정이 포함되어 있다고 안티센스 및 antigene 에이전트의 개발 42, 43, 라벨 및 올리고 뉴클레오티드 (41)의 기능 태그 등 다양한 실제 응용 프로그램에 대한 관심, 그리고 유전 알파벳 44-46을 확장하기 위해 노력합니다. 화학 변경 및 작용기는 일반적으로 표준 자동화 고체 상 합성 프로토콜을 적용하여 핵산에 도입된다. 그러나, 포스 빌딩 블록은 다시 화학적 기능 <sup…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 작품은 스위스 국립 과학 재단 (보조금 N PZ00P2_126430 / 1 ° 및 PZ00P2_144595)에 의해 지원되었다. 교수 C. Leumann 대해 감사의 실험실 공간 및 장비를 제공뿐만 아니라, 자신의 지속적인 지원에 대해 인정 받고 있습니다. 양 고소 KNECHT는 유익한 토론을위한 인정 받고 있습니다.

Materials

tributylammonium pyrophosphate  Sigma Aldrich P8533 Hygroscopic solid, keep under Ar
2-chloro-1,3,2-benzodioxaphosphorin-4-one  Sigma Aldrich 324124 Moisture sensitive
Pyridine Sigma Aldrich 82704 Under molecular sieves
Dioxane Sigma Aldrich 296309 Under molecular sieves
dimethylformamide (DMF) Sigma Aldrich 40248 Under molecular sieves
Acetonitrile  Fisher Scientific HPLC grade
Triethylamine Sigma Aldrich 90342
Tributylamine Sigma Aldrich 90781
ddH2O Milli-Q deionized and purified water, autoclaved in the presence of Diethylpyrocarbonate (DEPC)
Diethylpyrocarbonate (DEPC) Sigma Aldrich 159220
D2O Cambridge Isotope Laboratories, Inc. DLM-4-25
Biochemical reagents
g-[32P]-ATP Hartmann Analytics FP-301
Natural dNTPs Promega U1420
Vent (exo–) DNA polymerase NEB M0257S
DNA polymerase I, Large (Klenow) Fragment NEB MO210S
9°Nm DNA polymerase NEB MO260S
Terminal deoxynucleotidyl Transferase (TdT) Promega M828A
Pwo DNA polymerase Peqlab 01 01 5010
T4 PNK Thermo Scientific EK0032
Acrylamide/bisacrylamide (19:1, 40%) Serva 10679.01
Agarose Apollo Scientific BIA1177
G10 Sephadex Sigma G10120
Urea Apollo Scientific BIU4110
Equipment
Jupiter semi-preparative RP-HPLC column (5m C18 300Å) Phenomenex
Gene Q Thermal Cycler Bioconcept BYQ6042E
PCR vials Bioconcept 3220-00
HPLC system Amersham Pharmacia Biotech Äkta basic 10/100
Oligonucleotides
All oligonucleotides were purchased from Microsynth and purified by PAGE
5'-CAAGGACAAAATACCTGTATTCCTT P1
5'-GACATCATGAGAGACATCGCCTCTGGGCTAAT-AGGACTACTTCTAATCTGTAAGAGCAGATCCCTGG-ACAGGCAAGGAATACAGGTATTTTGTCCTTG T1
5'-GAATTCGATATCAAG P2
More information on experimental procedures and equipment can be found in the following articles:
Chem. Eur. J. 2012, 18, 13320 – 13330
Org. Biomol. Chem. 2013, DOI: 10.1039/C3OB40842F.
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Citar este artigo
Hollenstein, M., Smith, C. C., Räz, M. Nucleoside Triphosphates – From Synthesis to Biochemical Characterization. J. Vis. Exp. (86), e51385, doi:10.3791/51385 (2014).
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