Imunohistoquímica protocolos são usados para estudar a localização de uma proteína específica na retina. Técnicas de imagem de cálcio são utilizados para estudar a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axônios.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Os métodos de imagem de imuno-histoquímica e cálcio em Wholemount Rat Retina
Neste artigo
Resumo
Resumo
Neste artigo descrevemos as ferramentas, os reagentes e os passos práticos que são necessários para: 1) preparação bem-sucedida de retinas wholemount para imunohistoquímica e, 2) imagens de cálcio para o estudo da tensão fechado de canais de cálcio (VGCC) mediada sinalização de cálcio na retina células ganglionares. O método de imagem de cálcio que descrevem problemas contorna relativas à carga não-específica de células amácrinas deslocadas na camada de células ganglionares.
Introdução
As células ganglionares da retina (RGCs) expressar L, N, P / Q e T-tipo VGCC como determinado por meio do bloqueio farmacológico desses componentes de toda a célula actual canal Ca 1,2. VGCC são proteínas transmembrana multim�icos que estão envolvidos na liberação do transmissor, a transcrição do gene, regulação celular e sináptica 3,4,5 plasticidade. VGCCs funcionais são compostos de pelo menos três classes distintas de subunidades: grandes, transmembrana α 1 poro formando subunidades que estabelecem propriedades biofísicas e farmacológicas do canal, principalmente extracelular α auxiliar 2 δ subunidades e subunidades β ....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os experimentos foram realizados em conformidade com as orientações para o bem-estar dos animais experimentais de emissão da Política de Serviço de Saúde Pública dos EUA em Cuidado Humano e Uso de Animais de Laboratório e da Universidade da Califórnia-Los Angeles (UCLA) Comitê de Pesquisa Animal. Foram utilizados Macho e fêmea adultos ratos Sprague-Dawley (Charles River Lab, Wilmington, MA) entre a idade de 3-5 semanas.
1. Animais e Preparação de tecidos para Wholemount Retina e imunohistoquímica Protocolo
- Prepare os seguintes materiais e ferramentas: um microscópio de dissecação, 2 pinças com pontas muito finas, tesouras....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Imunomarcação com anticorpos específicos proporciona uma plataforma para o estudo da localização de proteínas de interesse particular na retina e na técnica de imagiologia de cálcio permite o estudo da contribuição dos VGCCs para a dinâmica de cálcio nas células ganglionares da retina e seus axónios.
Ao utilizar um anticorpo contra as células ganglionares RBPMS proteína (proteína de ligação de ARN com splicing múltipla) que rotula selectivamente CGRs 19, fomos capazes de demonstra.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Neste artigo, descrevemos duas técnicas diferentes: 1) Imunohistoquímica para mostrar Fluo-4 de localização para as células ganglionares da retina em wholemounts, e 2) Imagem de cálcio para analisar a dinâmica de cálcio em células ganglionares da retina e seus axônios.
A imuno-histoquímica utilizando wholemounts foi usado para revelar a localização de proteínas no roedor retina 20-23. No entanto, existem algumas limitações. A qualidade da coloração depende muito da capacidade do a.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Os autores não têm divulgações.
Agradecimentos
Agradecemos ao Dr. S. Stella e Helen Vuong para contribuições para o protocolo de imagem de cálcio. Agradecemos Sheets Dr. K. para filmar as cenas de entrevista. Agradecemos ao Dr. Arlene Hirano por seus comentários sobre o manuscrito. Este projeto de pesquisa e desenvolvimento foi realizado pelos autores na Geffen de Medicina David na UCLA e é possível graças a um acordo de contrato que foi concedido e administrado pela Research & Material Médico Comando do Exército dos EUA (USAMRMC) ea Telemedicina e Tecnologia Avançada Centro de Pesquisa (TATRC), em Fort Detrick, Maryland sob Número do Contrato: W81XWH-10-2-0077. O suporte para esses estudos também vieram NIH EY04....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tesoura reta | WPI | 14124-G | Ferramentas de dissecação |
| Pinça reta | WPI | 501985 | ferramentas de dissecação |
| tesoura de íris curva | WPI | 504487 | ferramentas de dissecação |
| Papel de filtro de celulose | Millipore | HABP04700 | |
| Hibernate A | Invitrogen | A12475-01 | Media |
| Vectashield | Vector | H-1000 | Mídia de montagem para fluorescência |
| Fluo-4 pentapotássio | Invitrogen | F-14200 | |
| Isoflurano | Abbott Laboratories | 05260-05 | anestesia |
| Lâmina de microscópio | Fisher Scientific | 22-178-277 | |
| Zeiss LSM 5 Microscópio Pascal | Zeiss | ||
| Axioplan 40X (NA 0,8) objetiva lente | Zeiss | ||
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Anticorpo | Molecular Probes | A-11034 | Anticorpo secundário |
| RBPMS | ProSci, Poway, CA | Um anticorpo policlonal de coelho foi gerado contra o terminal N do RBPMS polipeptídeo (RBPMS4-24), GGKAEKENTPSEANLQEEEVR, por um fornecedor comercial (ProSci, Poway, CA). |
Referências
- Guenther, E., et al. Separation of calcium currents in retinal ganglion cells from postnatal rat. Brain Res. 633, 223-235 (1994).
- Farrell, S. R., et al. Modulation of voltage-gated ion channels in rat retinal ga....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
