Embryonala nervceller föds i den ventrikulära zonen av neuralrörsdefekter, men flytta för att nå lämpliga mål. Facial branchiomotor (FBM) nervceller är en användbar modell för att studera neuronala migration. Detta protokoll beskriver wholemount ex vivo kultur av mus embryo hindbrains att undersöka mekanismer som reglerar FBM migration.
Embryonala nervceller föds i den ventrikulära zonen i hjärnan, men därefter migrera till nya destinationer för att uppnå lämpliga mål. Dechiffrera molekylära signaler som kooperativt styr neuronal migration i den embryonala hjärnan är därför viktigt att förstå hur de komplexa neurala nätverk bildas som senare stöder postnatal liv. Ansikts branchiomotor (FBM) neuroner i musembryo bakhjäman migrera från rhombomere (R) 4 kaudalt att bilda de parade ansiktskärnorna i r6-härledda regionen av hindbrain. Här ger vi ett detaljerat protokoll för wholemount ex vivo kultur av mus embryo hindbrains lämpliga för att undersöka de signalvägar som reglerar FBM migration. I denna metod är hindbrains av embryon E11.5 mus dissekeras och odlas i en öppen bok förberedelse på cellodlings skär för 24 tim. Under denna tid, FBM nervceller vandrar kaudalt mot r6 och kan utsättas för funktionsblockerande antikroppar och små molecules i odlingsmedier eller heparin kulor laddade med rekombinanta proteiner för att undersöka roller för signalvägar som är inblandade i att vägleda neuronal migration.
Embryonala nervceller föds i den ventrikulära zonen i hjärnan, men därefter migrera till nya destinationer för att nå lämpliga mål regioner som är belägna på stort avstånd. Rätt placering av neuronala cellkroppar i lämpliga platser längs de dorso-ventrala och främre-bakre axlarna för den växande hjärnan är avgörande för korrekt kabeldragning, överlevnad och funktion av dessa nervceller efter flyttande etapp 1-4. I likhet med de molekylära mekanismer som styr axon vägledning 5-7, är kombinatoriska uppsättningar av attraktiva och frånstötande ledtrådar tänkt att vägleda migrerar nervceller 1,8. Men på grund av samspelet mellan flera olika celltyper, de signaler som styr neuronal migration har mindre omfattande studier än dem som deltar i axonet vägledning, som kan studeras cell autonomt. Utvecklings bakhjäman av ryggradsdjur har använts i flera nya studier för att förstå de molekylära och cellulära mekanismerav neuronala migration, till exempel i chick, mus, och zebrafisk 1-4,9. Detta organ innehåller flera olika typer av nervceller, däribland flera subtyper av precerebellar och motoriska nervceller 5,7,10,11.
Bakhjäman motorneuron är födda i den ventrikulära zonen nära golvplatta, och de differentieras till specifika undergrupper enligt deras rhombomere ursprungs 1,12. Ansikts branchiomotor (FBM) nervceller genereras i rhombomere (r) 4 i bakhjäman och utvidga sina axoner dorsalt genom en R4 utgång i den andra brankiala valv till innerverar ansiktsmusklerna 2,9,13. FBM nervceller i zebrafisk och möss ger utmärkta modeller för att studera de molekylära och cellulära mekanismer för neuronal migration i en process som lätt visualiseras, eftersom dessa nervceller reproducerbart translocate sin somata i ett spatiotemporally väldefinierad process. Hos möss FBM neuroner först migrera Causöla genom R5 och sedan både kaudalt och ventralt nå sin slutliga ståndpunkt om pial sidan av hindbrain på territoriet i r6, där de bildar de parade kärnor av det sjunde hjärnnerven (Viin) 10,11,14. I zebrafisk, FBM nervceller först migrera ventralt och sedan ändra riktning på R4-r5 gränsen för att fortsätta att migrera mot pial ytan i ett laminin beroende sätt 4,12,15,16. Denna migration fortsätter under en period av flera dagar i utveckling och kan delas in i faser av tangentiell och radiell migration, vilket gör att identifieringen av molekyler som medierar dessa två skilda processer. I motsats härtill FBM neuroner i embryonal chick bakhjäman förbli i r4 3,13,17-19.
Under sin vandring, kan FBM nervceller identifieras, liksom andra typer eller motoriska nervceller, genom deras uttryck för homoeodomain transkriptionsfaktor holme 1 (ISL1) 14. Sålunda groemount immunofluorescensfärgning eller in situ hybridisering för denna markör vid olika utvecklingsstadier avslöjar distinkta vandrande ström av FBM somata sträcker sig från R4 till R6 i zebrafisk eller mus 4,15,16. Dessutom har fluorescerande transgena reportrar såsom ISL1-GFP använts som lämpliga verktyg för att visualisera migrera FBM nervceller i zebrafisk 3,17-19. Förutom att de är lämpliga för avbildning, har många forskare studerat migration av FBM neuroner i utveckla zebrafisk, eftersom deras fritt levande embryon kan manipuleras enkelt med celltransplantationstekniker och farmakologiska föreningar appliceras direkt på akvarievatten. Däremot utvecklar musen embryot inneslutna i livmodern, utgör hinder implantation av pärlor som bär vägledning ledtrådar eller administration av funktionsblockerande antikroppar som inte korsar placentabarriären. Dessutom kan farmakologiska föreningar administreras till den gravida modern har unönskvärda biverkningar som indirekt kan försämra embryogenes. Kringgå denna begränsning, har vi utvecklat en ex vivo odlingsmetod för hela mus bakhjäman som är kompatibel med FBM neuron migration och överlevnad för 24 timmar efter explantation 7,16. Denna metod gör det lätt farmakologisk manipulation, implantation av pärlor som bär vägledning ledtrådar eller administration av funktionsblockerande antikroppar och kan även anpassas för att studera migration av andra neuronala subtyper i bakhjäman vid olika utvecklingsstadier.
Detta protokoll beskriver wholemount kultur E11.5 mus hindbrains i ett transwell system för att studera migration av FBM nervceller. Detta protokoll möjliggör mus bakhjäman motorneurons att hållas vid liv och att migrera under en period av 24 timmar, vilket möjliggör ex vivo manipulation. Denna metod har många experimentella fördelar för utredare som söker att identifiera de molekylära och cellulära mekanismer för neuronal migration. Medan traditionella migrationsanalyser explantera små neurala vävnadsbitar i matrisen på kultur rätter och möjliggör observation av enskilda nervceller när de reagerar på yttre stimuli, är en stor fördel med transwell analysen dess lämplighet att manipulera migrerar nervceller i värdorganmiljön och därmed en mer fysiologiskt sammanhang. Viktigt kan ämnen med lätthet appliceras på ex vivo bakhjäman explants att testa deras effekt på neuronala migration, kringgå eventuella biverkningar som förknippas med administering dessa ämnen till en gravid mus. Slutligen, den ex vivo-modell gör också testning av ämnen som inte korsar placentabarriären, såsom funktionsblockerande antikroppar. På grund av dessa fördelar, ger ex vivo bakhjäman kultur en alternativ och kompletterande metod för att med hjälp av zebrafisk embryon, som kan behandlas med vattenlösliga små molekyler i akvariet vatten, eller i livmodern elektroporering av embryonala hjärnor, som kräver användning av specialiserade utrustning och är svårare att behärska än odlingstekniken beskriven här. En annan fördel med det protokoll som beskrivs här är dess mottaglighet för implantation pärlor indränkt i rekombinant protein eller andra reagens, därför tillåter tillämpningen av en standard embryo metod som utvecklats för att manipulera kycklingembryon till en musmodell av neuronala migration. I synnerhet kan den ex vivo odlingsmodell appliceras hindbrains av genetiskt manipulerade möss defektativ i specifika molekyler inblandade i neuronala migration, till exempel tillväxt eller vägledning receptorer, och i kombination med pärla implantat för att testa om lyhördhet för ligander är förlorad. Förutom farmakologisk manipulation kan den ex vivo kultur protokoll också anpassas för att elektroporera expressionsvektorer som kan manipulera uttryck av gener av intresse, lämpliga metoder för elektroporation har tidigare beskrivits 22,23. Detta protokoll kan också anpassas för att visualisera neuron migration av tidsförlopp mikroskopi i hindbrain explantat från transgena möss som innehåller fluorescerande FBM nervceller, t.ex. Isl1-Cre, Rosa26Yfp 21. Slutligen kan detta protokoll också användas för att studera andra typer av flytt neuroner i bakhjäman, såsom de som bildar den underlägsna olivolja, även om detta skulle kräva användning av hindbrains vid äldre embryonala stadier och kan kräva odling under upp till 48 timmar, beroende på neuronal viabilitet <em> Ex vivo.
Kritiska steg och felsökning
För att lyckas med detta protokoll är det viktigt att embryon samlas tidigt på dagen E11.5, närmare E11.25, när FBM neuron migration just har börjat. Emellertid är det inte alltid möjligt att fånga embryon på detta utvecklingsstadium på grund av naturlig parning variabilitet av möss, och följaktligen kan det finnas vissa variationer i omfattningen av FBM migration mellan olika experiment. Variationen i FBM migration kan också observeras om experimentet inte slutförs inom den tidsram som tilldelats, ca 3 timmar, vilket kan ses i figur 3E. Bakhjäman vävnad från E11.25 musembryon är känslig. När dissekera och hela explantatet förfarandet är det viktigt att inte slita bakhjäman vävnad i områden från r4-r6 där FBM neuroner är lokaliserade. På grund av den känsliga naturen av dissektion process, och eftersom den hastighet med vilken hindbrains placeras i kultur påverkar resultatet, kan proceduren ta några praktiken går att bemästra, särskilt innan dyrbara prover eller reagenser används. Slutligen är det viktigt att den bakhjäman vävnaden placeras i en bok konfigurationen öppen på odlingsinsatsen, eftersom vikningen av hindbrain vävnad under odling kommer att förhindra normal FBM migration (se figur 3F).
The authors have nothing to disclose.
MT är uppburen av en doktorand [ref. 092839/Z/10/Z] och CR med en ny Investigator Award [ref. 095623/Z/11/Z] från Wellcome Trust.
Eppendorf round-bottomed reagent tube, 2.0 ml (Safe-Lock) | VWR | 211-2120 | |
Cell culture plates, 12 well | Thermo Scientific | 150628 | |
Plastic cell culture dish, 100 mm | Thermo Scientific | 150288 | |
15 mm Netwell insert with Mesh Polyester Membrane | Corning | 3477 | |
Watchmaker forceps, no. 5 | Dumont | 91150-20 | |
Phosphate buffered saline | Sigma | P4417 | |
Laminin mouse protein | Life Technologies | 23017-015 | |
Primary antibody, Isl1 | Developmental Hybridoma Bank | 39.4D5 | Dilution 1/100 |
AlexaFluor 488-conjugated goat anti mouse secondary antibody | Life Technologies | A11029 | Dilution 1/200 |
Neurobasal medium | Life Technologies | 21103 | |
B27 supplement (50x) | Life Technologies | 17504-044 | |
Leibovitz’s L-15 | Life Technologies | 21083-027 | |
Penicillin/ streptomycin | Life Technologies | 15070 | |
Glucose | VWR | 101174Y | |
Heat-inactivated goat serum | Sigma | G9023 | |
Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
Slowfade Antifade Kit | Life Technologies | S-2828 | Alternative mounting solutions may be used |
Microscope slides | VWR | 631-0912 | |
Cover glass | VWR | 631-0137 | |
Affi-Gel Heparin Beads | Biorad | 153-6173 | Glass, latex, or coloured beads may be used alternatively |
Recombinant human VEGF165 | R&D systems | 293-VE | Resuspend in PBS, store aliquots at -80oC |
Stereo Microscope, Leica MZ16 | Leica | ||
Confocal laser scanning microscope LSM710 | Zeiss |