मात्रात्मक RT-पीसीआर से व्यक्ति मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं की रूपरेखा
Summary
सिंगल सेल जीन अभिव्यक्ति परख स्टेम सेल विषमताओं को समझने के लिए आवश्यक है.
Abstract
स्टेम सेल जनसंख्या की विविधता ऐसी विभिन्न प्रजातियों की ओर उनके भेदभाव प्रवृत्ति के रूप में, स्टेम कोशिका जीव विज्ञान के विस्तृत समझ बाधित. एक एकल कक्ष transcriptome परख व्यक्तिगत परिवर्तन विदारक के लिए एक नया दृष्टिकोण हो सकता है. हम एकल कक्ष QRT-पीसीआर विधि विकसित की है, और इस विधि कई जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल में अच्छी तरह से काम करता है कि इस बात की पुष्टि की है. एकल कोशिका के स्तर में, Oct4 के अनुसार क्रमबद्ध प्रत्येक मानव भ्रूण स्टेम सेल, :: EGFP सकारात्मक कोशिकाओं, Oct4 में उच्च अभिव्यक्ति, लेकिन Nanog अभिव्यक्ति का एक अलग स्तर पर है. हमारे एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति परख आबादी विषमताओं पूछताछ के लिए उपयोगी होना चाहिए.
Introduction
अधिकांश उच्च यूकेरियोट आबादी जमा आबादी के विश्लेषण के साथ इस प्रकार विषम रहे हैं, यह उनके सेलुलर सुविधाओं की व्याख्या करने के लिए अक्सर मुश्किल होता है. आबादी के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं आसानी से अलग किया जा सकता है, और इन मतभेदों को पूरी आबादी 1, 2 की संपत्ति और समारोह के लिए महत्वपूर्ण परिणाम हो सकते हैं. विशेष रूप से, मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं (hESCs) नाजुक विशिष्ट तरीके 3, 4 में वंश विनिर्देश के pluripotency के विभिन्न स्तरों और विविध क्षमता का कारण बनता है, जो विषम हो जाना जाता है. उदाहरण के लिए, विभिन्न कोशिका की सतह एंटीजन undifferentiated pluripotent स्टेम कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, 5 और ऑस्टिन स्मिथ समूह उनकी आकृति विज्ञान, भेदभाव प्रवृत्ति और मार्ग 6 सिगनल की निर्भरता पर आधारित, माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं में pluripotency के विभिन्न स्तरों का प्रस्ताव रखा. यह घटना मानव भ्रूण में धारणा थीएनआईसी स्टेम कोशिकाओं 7. समग्र पढ़ाई अलग स्टेम सेल लाइनों, न कि व्यक्तिगत एकल स्टेम कोशिकाओं के बीच प्रदर्शन किया गया है, जबकि यह संभवतः सभी दैहिक सेल प्रजातियों की ओर उनके भेदभाव क्षमता को प्रभावित करता है जो एकल कोशिका के स्तर पर pluripotency के विभिन्न स्तरों का विश्लेषण करने के लिए बहुत पेचीदा हो सकता है.
सेलुलर और आणविक विविधता 'एकल कक्ष transcriptome' कहा जाता है, जो प्रतिलेखन रूपरेखा तय करती है और जीन अभिव्यक्ति के स्तर 8-10 बढ़ाता के लिए नए तरीकों पर जोर दिया जा सकता है. व्यक्ति की कोशिकाओं में जीन की अभिव्यक्ति के स्तर के विश्लेषण के लिए, हम एकल कक्ष मात्रात्मक RT-पीसीआर की एक सरल, लेकिन मजबूत प्रोटोकॉल विकसित की है. हम कम से कम तकनीकी विविधताओं और मतभेद में जिसके परिणामस्वरूप, प्रत्येक एकल कक्ष lysates के आधे के साथ ही hESCs के क्रमानुसार पतला कुल RNAs तुलना करके हमारे प्रोटोकॉल की प्रभावकारिता और व्यवहार्यता की पुष्टि की. इसके अलावा, हम समरूप पी अलग करने के लिए एक आनुवंशिक संवाददाता लाइन का इस्तेमाल कियाजीन लक्ष्यीकरण प्रणाली का उपयोग hESCs के opulation. Oct4 ठिकाना (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro निर्माण) और talen plasmids के एक जोड़ी को निशाना बनाने के लिए दाता वेक्टर 11 इस्तेमाल किया गया. दाता वेक्टर और talen plasmids के एक जोड़ी हमारे nucleofection और प्रतिरूप चयन प्रोटोकॉल और hESCs हमारी दिनचर्या प्रोटोकॉल 12 के आधार पर प्रदर्शन किया गया था के रखरखाव का उपयोग hESCs (H9, WA09) में शुरू किए गए थे. हम इस आनुवंशिक संवाददाता लाइन Oct4 में oct4 अभिव्यक्ति के लिए EGFP व्यक्त :: EGFP hESCs की पुष्टि की.
हमारे परिणाम (Oct4 के अनुसार क्रमबद्ध :: EGFP दृढ़ता से सकारात्मक कोशिकाओं) व्यक्तिगत hESCs Oct4 अभिव्यक्ति के उच्च स्तर पर है, लेकिन Nanog अभिव्यक्ति के विभिन्न स्तरों कि पकड़ को दर्शाता है. तो, हमारी एकल कोशिका जीन अभिव्यक्ति परख pluripotent स्टेम सेल की आबादी विषमताओं के अध्ययन करने के लिए उपयोगी होना चाहिए.
Protocol
Representative Results
Discussion
सिंगल सेल जीन रूपरेखा एक एकल कक्ष की कार्यक्षमता या एक पूरी आबादी की भविष्यवाणी करने के लिए एक प्रमुख साधन हो सकता है. कारण तकनीकी सीमा तक, पूरे जीन रूपरेखा विश्लेषण आबादी के औसत के लिए प्रतिबंधित कर दि?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम पांडुलिपि पर बहुमूल्य विचार विमर्श के लिए ली प्रयोगशाला के सदस्यों को धन्यवाद देना चाहूंगा. ली प्रयोगशाला में काम सेल रिसर्च फंड (TEDCO) स्टेम न्यूयॉर्क स्टेम सेल फाउंडेशन की रॉबर्टसन अन्वेषक पुरस्कार से और मेरीलैंड से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| 96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
Referências
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