אפיון תאי גזע עוברי האנושי על ידי הפרט כמותי RT-PCR
Summary
assay ביטוי גני תא הבודד שדרוש להבנת heterogeneities בתאי גזע.
Abstract
ההטרוגניות של אוכלוסיית תאי גזע פוגעת בהבנה מפורטת של ביולוגיה של תאי גזע, כגון הנטייה הבידול שלהם כלפי שושלות שונות. Assay transcriptome התא בודד יכול להיות גישה חדשה ללנתח וריאציה בודדת. פיתחנו שיטת qRT-PCR תא הבודד, ואישרתי כי שיטה זו עובדת היטב במספר פרופילי ביטוי גנים. ברמת תא בודדת, כל תא גזע עוברי אנושי, מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים EGFP, יש ביטוי גבוה בOct4, אבל רמת ביטוי Nanog שונה. assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי לחקור heterogeneities אוכלוסייה.
Introduction
אוכלוסיות eukaryote רוב גבוהות יותר הן הטרוגנית וכך עם ניתוח של אוכלוסייה נקוותה, הוא לעתים קרובות קשה לפרש תכונות הסלולריות שלהם. תאים בודדים בתוך אוכלוסייה עשויים להיות מעט שונים, והבדלים אלה יכולים להיות השלכות חשובות עבור הנכס והתפקוד של כל האוכלוסייה 1, 2. במיוחד, תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) ידועים להיות הטרוגניות, מה שגורם לרמות שונות של pluripotency ופוטנציאלים מגוונים למפרט שושלת בעדינות דרכים ייחודיות 3, 4. לדוגמא, ניתן להשתמש בם פני השטח אנטיגנים תא שונים כדי לסווג את תאי גזע pluripotent מובחנים, 5 וקבוצת אוסטין סמית מוצעת רמות שונות של pluripotency בתאי גזע העובריים של עכברים, המבוססים על המורפולוגיה, הנטייה והתלות של מסלול איתות 6 הבידול שלהם. תופעה זו הייתה שיערו בעובר אנושיתאי גזע NIC 7. בעוד שהמחקרים הכוללים בוצעו בין קווים שונים בתאי גזע, ולא בתאי גזע אחד בודדים, זה יכול להיות מאוד מעניין לנתח את הרמות של pluripotency שונים ברמת התא הבודד, אשר באופן פוטנציאלי משפיעה על יכולות ההבחנה שלהם כלפי כל שושלות התאים סומטיים.
הטרוגניות תאית ומולקולרית יכולה להיות מוכתבת על ידי פרופיל שעתוק, אשר נקראה "transcriptome התא הבודד 'ומדגישה גישות חדשות לכימות רמות ביטוי הגנים 8-10. לניתוח של רמות ביטוי הגנים בתאים בודדים, פיתחנו פרוטוקול פשוט, אבל חזק של תא הבודד RT-PCR. אנחנו אישרו את היעילות ואת הכדאיות של הפרוטוקול שלנו על ידי השוואת כל מחצית lysates תא הבודד, כמו גם RNAs הכולל דילול סדרתי של hESCs, וכתוצאה מוריאציות טכניות מינימליות והבדלים. יתר על כן, אנו משמשים קו כתב גנטי לבודד עמ הומוגניתopulation של hESCs באמצעות מערכת מיקוד גן. הווקטור התורם למיקוד לוקוס Oct4 (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro לבנות) וזוג פלסמידים Talen שימש 11. וקטור התורם וזוג פלסמידים Talen הוכנסו hESCs (H9, WA09) באמצעות nucleofection ופרוטוקול בחירה משובט והתחזוקה של hESCs בוצע על בסיס פרוטוקול השגרה שלנו 12. אנחנו אישרו שורת כתב זה גנטי לבטא EGFP לביטוי Oct4 בOct4 :: EGFP hESCs.
התוצאה שלנו מוכיחה כי hESCs הבודד (מסודרים על ידי Oct4 :: תאים חיוביים מאוד EGFP) להחזיק רמות גבוהות של ביטוי Oct4, אבל רמות של ביטוי Nanog שונות. לכן, assay הביטוי שלנו בודד גן התא צריך להיות שימושי ללמוד heterogeneities אוכלוסייה של תאי גזע pluripotent.
Protocol
Representative Results
Discussion
פרופיל גנטי תא בודד יכול להיות כלי עיקרי לחזות את הפונקציונליות של תא בודד או אוכלוסייה שלמה. עקב מגבלות טכניות, ניתוח פרופיל הגנטי כולו הוגבל לממוצע אוכלוסייה. שינויים בדפוסי ביטוי גנים והרמות בין תאים הבודדים והאוכלוסיות הוצעו לגרום לפרשנות מוטעה. ניתן למצוא היבט?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו רוצים להודות לחברים במעבדה לי לדיונים חשובים על כתב היד. עבודה במעבדה לי נתמכה על ידי מענקים מרוברטסון פרס חוקר של קרן לתאי גזע בניו יורק וממרילנד לתאי גזע למחקר קרן (TEDCO).
Materials
| 96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
Referências
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O’Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
