Profilering individuella mänskliga embryonala stamceller genom kvantitativ RT-PCR
Summary
Enda cell genuttryck analys behövs för att förstå stamcellsheterogeniteter.
Abstract
Heterogenitet av stamceller befolkningen försvårar detaljerad förståelse av stamcellsbiologi, såsom deras differentiering benägenhet mot olika härstamningar. En enstaka cell transkriptom-analys kan vara en ny metod för att dissekera individuell variation. Vi har utvecklat den enda cell QRT-PCR-metoden, och bekräftade att denna metod fungerar bra i flera genuttrycksprofilerna. I en enda cell nivå har varje mänskliga embryonala stamceller, sorterade efter Oct4 :: EGFP positiva celler, högt uttryck i Oct4, men en annan nivå av NANOG uttryck. Vår enda cell genuttryck analys bör vara användbart för att förhöra befolkningsheterogeniteter.
Introduction
De flesta högre eukaryota populationer är heterogena således med analys av integrerade populationsdata, är det ofta svårt att tolka deras cellulära funktioner. Individuella celler i en population kan vara subtilt annorlunda, och dessa skillnader kan få betydande konsekvenser för fastigheten och funktionen av hela befolkningen 1, 2. Speciellt är mänskliga embryonala stamceller (hESCs) kända för att vara heterogent, vilket orsakar olika nivåer av pluripotens och olika potentialer för härstamning specifikation i fint distinkta sätt 3, 4. Exempelvis kan olika cellyteantigener användas för att kategorisera odifferentierade pluripotenta stamceller, 5 och Austin Smith gruppen föreslagit olika nivåer av pluripotens i mus embryonala stamceller, baserat på deras morfologi, differentiering benägenhet och beroendet av signalväg 6. Detta fenomen hypotes i mänskligt embryonic stamceller 7. De generella studier utfördes bland olika stamcellslinjer, inte enskilda enstaka stamceller, kan det vara mycket intressant att analysera olika nivåer av pluripotens på enskild cellnivå, som eventuellt påverkar deras differentieringskapacitet mot alla somatiska cellinjer.
Cellulär och molekylär heterogenitet kan dikteras av transkriptionsprofilering, som kallas den "enda cell transcriptome" och betonar nya metoder för att kvantifiera genuttryck nivåer 8-10. För analys av genuttryck nivåer i enskilda celler, utvecklade vi en enkel, men robust protokoll för enskild cell kvantitativ RT-PCR. Vi bekräftade effektiviteten och genomförbarheten av våra protokoll genom att jämföra varje halva av enstaka cellysater samt serieutspädda total RNA av hESCs, vilket resulterar i minimala tekniska variationer och skillnader. Vidare använde vi en genetisk reporter linje att isolera homogen pBefolknings av hESCs hjälp av riktad genmodifiering systemet. Donator vektor för måls Oct4 lokus (Oct4-2A-EGFP-PGK-Puro konstruera) och ett par Talen plasmider användes 11. Donatorvektor och ett par talen plasmider infördes i hESCs (H9, WA09) med hjälp av vår nucleofection och klonurvalet protokoll och underhåll av hESCs utförts baserat på vår rutin protokoll 12. Vi bekräftade detta genetiska reporter linje uttrycker EGFP för Oct4 uttryck i Oct4 :: EGFP hESCs.
Vårt resultat visar att enskilda hESCs (sorterade efter Oct4 :: EGFP starkt positiva celler) håller hög Oct4 uttryck, men olika nivåer av NANOG uttryck. Så ska vår enda cell genuttryck analys vara intressant att studera befolkningsheterogeniteter av pluripotenta stamceller.
Protocol
Representative Results
Discussion
Enda cell genen profilering kan vara ett viktigt verktyg för att förutsäga funktionaliteten i en enda cell eller en hel befolkning. På grund av tekniska begränsningar, har hela gen profilanalys begränsats till medelvärden befolkningen. Variationer i genuttryck mönster och nivåer mellan enskilda celler och subpopulationer har föreslagits för att orsaka felaktig tolkning. Sådana olika cellulära aspekter finns i hESCs och deras heterogenitet orsakar subtilt annorlunda förmåga att bibehålla pluripotens och ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi vill tacka medlemmarna i Lees lab för värdefulla diskussioner om manuskriptet. Arbetet i Lee labbet har finansierats med bidrag från Robertson Investigator Award i New York Stem Cell Foundation och från Maryland Stem Cell Research Fund (TedCo).
Materials
| 96 wll PCR Plate | USA scientific | 1402-8900 | |
| Ambion Cell Lysis Kit | Life Technologies | 4458235 | |
| SMARTScribe Reverse Transcriptase | Clonetech | 639536 | |
| ExoSAP-IT | USB | 78200 | |
| Platinum Taq DNA polymerase High Fidelity | Invitrogen | 11304 | |
| 10mM dNTP Mix, PCR Grade | Invitrogen | 18427 | |
| SYBR Universal 2X Master Mix | Kapa biosystem | KR0389 | |
| Accutase | Innovative Cell Tech | S-1100-1 | |
| FACS buffer | 45 ml PBS, 5 ml a-MEM, 100 ul DNase, filter sterilized | ||
| 35 μm cell strainer cap tubes | BD Biosciences | 352235 |
Referências
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Leitch, H. G., et al. Embryonic germ cells from mice and rats exhibit properties consistent with a generic pluripotent ground state. Development. 137, 2279-2287 (2010).
- Ramskold, D., et al. Full-length mRNA-Seq from single-cell levels of RNA and individual circulating tumor cells. Nat Biotechnol. 30, 777-782 (2012).
- Stewart, M. H., et al. Clonal isolation of hESCs reveals heterogeneity within the pluripotent stem cell compartment. Nat Methods. 3, 807-815 (2006).
- O’Malley, J., et al. High-resolution analysis with novel cell-surface markers identifies routes to iPS cells. Nature. 499, 88-91 (2013).
- Nichols, J., Smith, A. Naive and primed pluripotent states. Cell Stem Cell. 4, 487-492 (2009).
- Kim, H., et al. miR-371-3 expression predicts neural differentiation propensity in human pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 8, 695-706 (2011).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., Mccue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nat Methods. 5, 621-628 (2008).
- Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, J., Blencowe, B. J. Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing. Nat Genet. 40, 1413-1415 (2008).
- Wang, E. T., et al. Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes. Nature. 456, 470-476 (2008).
- Hockemeyer, D., et al. Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases. Nat Biotechnol. 29, 731-734 (2011).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Zhu, Y. Y., Machleder, E. M., Chenchik, A., Li, R., Siebert, P. D. Reverse transcriptase template switching: A SMART (TM) approach for full-length cDNA library construction. Biotechniques. 30, 892-897 (2001).
- Pan, X. H., et al. Two methods for full-length RNA sequencing for low quantities of cells and single cells. P Natl Acad Sci USA. 110, 594-599 (2013).
- Tang, F. C., et al. RNA-Seq analysis to capture the transcriptome landscape of a single cell. Nat Protoc. 5, 516-535 (2010).
