En Full Skin Defect modell för att utvärdera Vaskularisering av biomaterial<em> In Vivo</em
Summary
Vaskularisering är nyckeln till metoder inom framgångsrik vävnadsteknik. Därför är tillförlitlig teknik som krävs för att bedöma utvecklingen av vaskulära nätverk i vävnads-konstruktioner. Här presenterar vi en enkel och kostnadseffektiv metod för att visualisera och kvantifiera vaskularisering in vivo.
Abstract
Otillräcklig vaskularisering anses vara en av de viktigaste faktorer som begränsar den kliniska framgången av vävnadstekniska konstruktioner. För att utvärdera nya strategier som syftar till att förbättra vaskularisering, är tillförlitliga metoder krävs för att göra inväxt av nya blodkärl i bio-konstgjorda ställningar synliga och kvantifiera resultaten. Under de senaste åren har vår grupp infört en hel hud defekt modell som gör det möjligt att direkt visualisering av blodkärl genom genomlysning och ger möjlighet till kvantifiering via digital segmentering. I denna modell, en kirurgiskt skapar hela skalet på baksidan av möss och ersätter dem med det provade materialet. Molekyler eller celler av intresse kan också införlivas i sådana material för att studera deras eventuella betydelse. Efter en observationstid av ens eget val, material explanterades för utvärdering. Bilaterala sår ger möjligheten att göra interna jämförelser thåtmin minimera artefakter mellan individer samt att minska antalet djur som behövs för studien. I jämförelse med andra metoder, erbjuder vår metod en enkel, pålitlig och kostnadseffektiv analys. Vi har genomfört den här modellen som en rutinmässig verktyg för att utföra högupplösta screening vid provning av vaskularisering av olika biomaterial och biologiska aktiverings metoder.
Introduction
Under de senaste decennierna har vävnadsteknik öppnat ett nytt behandlingsalternativ för att ersätta vävnadsdefekter med kroppens egna celler 1. För att stödja den fysiologiska processen för vävnadsregenerering, är byggnadsställningar konstruerad som en biologiskt nedbrytbar struktur, som ger ett scenario där celler från sårbädden kan växa och återställa defekten 2,3.
Otillräcklig vaskularisering anses vara det främsta hindret, vilket håller tillbaka den kliniska genombrott bioartificiella byggnadsställningar 4. Med inväxt av celler, blir efterfrågan på näringsämnen och syre ökar och vaskularisering av materialet viktigt. Otillräcklig eller fördröjd vaskularisering kan därför leda till central nekros av vävnadstekniska produkter 5. Dessutom blodkärl ger immunkompetenta celler och ta bort de metaboliska rester i regenereområdet. Höga smittade och låga regenere är baranågra av konsekvenserna av otillräcklig blod perfusion observerats i vävnadsteknik, som syftar till avvärjas genom att öka vaskularisering av byggnadsställningar 6,7.
Flera strategier som syftar till att förbättra vaskularisering fokus på den nyckelroll biomaterialet själv och mikrostruktur schavotten. Det finns intensiva forskningsinsatser för att utveckla nya metoder i att skifta läkningsprocessen från reparationer till förnyelse, och därmed (åter) genererar en vävnad med de närmaste fysiologiska egenskaper till en att återställas 8,9. Biomaterial som studerades och utvärderades med avseende på deras regenerativa potentialen ingår kollagen, fibrin, kitosan och alginat 10,11. Dessa biomaterial kan användas och kombineras som en ryggrad för att bygga nya ställningar med hjälp av olika strategier såsom vävnads decellularisering, monterings, rapid prototyping och elektrospinning 12. För att ENHning kroppens egen förnyelseförmåga, kan byggnadsställningar bioaktiveras. Införlivandet av rekombinant angiogenes tillväxtfaktorer 13 eller gen som kodar för sådana faktorer 14 har visat sig förbättra vaskularisering av ställningen. Användningen av stamceller har i stor utsträckning visat sig vara en lovande strategi för att förbättra vaskularisering, där mesenkymala stromaceller och endotelceller progenitorceller har fått mest uppmärksamhet 15,16. Andra metoder försöker bygga konstruktioner som innehåller prefabricerade fartygsnätverk före transplantation 17. Trots ett intensivt arbete i byggnadsställning konstruktion och deras biologiska aktivering, har någon strategi förbättrad vaskularisering vid en kliniskt signifikant nivå, med undantag för dermala ersättare i massiva brännskador, är översättningen av bioengineered material i klinisk rutin endast sker tvekande 18 .
En av anledningarna till vaskulariseringkonstgjorda vävnads konstruktioner är fortfarande ett olöst problem är svårigheten att bedöma framgången för ny teknik i in vivo-metoder. Även om in vitro-experiment kan ge viktiga insikter i vascularization potentialen av byggnadsställningar, är lämpliga djurmodeller som krävs för att studera nyckelparametrar såsom biokompatibilitet av materialet, säkerhet och effekt av behandlingen och, av särskild betydelse, vaskularisering av vävnaden konstruera. Därför att tillförlitliga verktyg visualisera och kvantifiera blodkärlsnätverk in vivo är väsentliga.
I denna studie presenterar vi en enkel och tillförlitlig metod som tillåter visualisering och kvantifiering av det vaskulära nätverket inuti explanterade byggnadsställningar. Denna metod bygger på vävnads genomlysning och digital segmentering. Eftersom denna metod är icke-invasiv, gör det ytterligare molekylära och histologiska analyser av målmaterial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Det finns ett behov av att fastställa framgångsrika metoder för att förbättra blodgenomströmningen i vävnadstekniska konstruktioner, som kräver utveckling av nya tillförlitliga metoder för att studera vaskularisering processerna inom biomaterial. Vanliga metoder för framställning av byggnadsställning vaskularisering ex vivo synlig inkluderar användning av mikroskopi, som ger en hög upplösning verktyg. I de flesta fall är dock denna metod begränsad till analys av små vävnadsområden och tende…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Integra dermal förnyelse mall vänligen av Integra Lifesciences Corporation. Finansieringskällor som stöder arbetet: Detta arbete har delvis finansierats av CIRM-BMBF Tidig Translational II Award och FONDAP Center for Genome förordningen både JTE (Nr 15.090.007.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Ethilon P-3 13 mm 3/8 circle 5-0 | Ethicon, Norderstedt, Germany | 698G | Ethilon polyamid-6 precision point-reverse cutting suture |
| Biopsy punches (10 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1050 | |
| Biopsy punches (12 mm) | Xiomedics, Acuderm inc., Fort Lauderdale, FL, USA | P1250 | |
| Digital camera | Ricoh, Hannover, Germany | Cx1 | |
| Gazin Mullkompresse | Lohmann und Rauscher, Neuwied, Germany | 13622 | Sterile gauze (10 cm x 10 cm) |
| Double-layer collagen-based scaffold (8 'x 10') | Integra Life Science Corporation, Plainsboro, NJ, USA | 88101 | |
| Isoflurane, liquid-gas for inhalative anesthesia | Baxter, Unterschleissheim, Germany | 100196040 | |
| Pentobarbital, 16 g / 100 ml | Fa. Merial, Hallbergmoos | ||
| Nuri Nu/Nu Nude mice, CrLNU-Foxn1nu | Charles River, Sulzfeld, Germany | Strain code 088 | Athymic nude mice, 6 to 8 weeks of age and with a body weight between 20 to 25 g |
| Buprenorphine (0.3 mg/ml) | Essex Pharma GmbH, Munich, Germany | ||
| Titanized mesh (15 cm x 15 cm), extralight | PFM Medical AG, Köln, Germany | 6000029 | |
| Tissucol Duo S Immuno 2 ml | Baxter Germany GmbH, Unterschleißheim, Germany | B1332020110614 | Fibrin-thrombin solution |
| Transparent adhesove drape (30.5 cm x 26 cm) | KCI Medical Products, Wimborne Dorset, UK | M6275009/10 |
References
- Rahaman, M. N., Mao, J. J. Stem cell-based composite tissue constructs for regenerative medicine. Biotechnology and Bioengineering. 91 (3), 261-284 (2005).
- Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering. Nature Biotechnology. 23, 47-55 (2005).
- Machens, H. G., Berger, A. C., Mailaender, P. Bioartificial skin. Cells Tissues Organs. 167, 88-94 (2000).
- Priya, S. G., Jungvid, H., Kumar, A. Skin tissue engineering for tissue repair and regeneration. Tissue Engineering Part B: Reviews. 14, 105-118 (2008).
- Papavasiliou, G., Cheng, M. H., Brey, E. M. Strategies for vascularization of polymer scaffolds. Journal of Investigative Medicine. 58 (7), 838-844 (2010).
- Laschke, M. W., et al. Angiogenesis in tissue engineering: breathing life into constructed tissue substitutes. Tissue Engineering. 12, 2093-2104 (2006).
- Zhong, S. P., Zhang, Y. Z., Lim, C. T. Tissue scaffolds for skin wound healing and dermal reconstruction. Wiley Interdisciplinary Reviews Nanomedicine and Nanobiotechnology. 2 (5), 510-525 (2010).
- Liu, G., Zhang, Y., Liu, B., Sun, J., Li, W., Cui, L. Bone regeneration in a canine cranial model using allogeneic adipose derived stem cells and coral scaffold. Biomaterials. 34 (11), 2655-2664 (2013).
- Hansson, A., Di Francesco, T., Falson, F., Rousselle, P., Jordan, O., Borchard, G. Preparation and evaluation of nanoparticles for directed tissue engineering. International Journal of Pharmaceutics. 439 (1-2), 73-80 (2012).
- Sarkar, S. D., Farrugia, B. L., Dargaville, T. R., Dhara, S. Chitosan-collagen scaffolds with nano/microfibrous architecture for skin tissue engineering. Journal of Biomedical Materials Research Part A. 18, (2013).
- Wang, X., et al. The roles of knitted mesh-reinforced collagen-chitosan hybrid scaffold in the one-step repair of full-thickness skin defects in rats. Acta Biomaterials. 9 (8), 7822-7832 (2013).
- Rizzi, S. C., Upton, Z., Bott, K., Dargaville, T. R. Recent advances in dermal wound healing: biomedical device approaches. Expert Review of Medical Devices. 1, 143-154 (2010).
- des Rieux, A., et al. 3D systems delivering VEGF to promote angiogenesis for tissue engineering. Journal of Controlled Release. 150, 272-278 (2011).
- Reckhenrich, A. K., et al. Bioactivation of dermal scaffolds with a non-viral copolymer-protected gene vector. Biomaterials. 32, 1996-2003 (2011).
- Chen, J., et al. The Key Regulatory Roles of the PI3K/Akt Signaling Pathway in the Functionalities of Mesenchymal Stem Cells and Applications in Tissue Regeneration. Tissue Engineering Part B Rev. 19, 516-528 (2013).
- Fedorovich, N. E., et al. The role of endothelial progenitor cells in prevascularized bone tissue engineering: development of heterogenous constructs. Tissue Engineering Part A. 16 (7), 2355-2367 (2010).
- Wang, L., et al. Osteogenesis and angiogenesis of tissue-engineered bone constructed by prevascularized β-tricalcium phosphate scaffold and mesenchymal stem cells. Biomaterials. 36, 9452-9461 (2010).
- Cuadra, A., et al. Functional results of burned hands treated with Integra. Journal of Plastic, Reconstructive & Aesthetic Surgery. 65 (2), 228-234 (2012).
- Wilcke, I., et al. VEGF(165) and bFGF protein-based therapy in a slow release system to improve angiogenesis in a bioartificial dermal substitute in vitro and in vivo. Langenbecks Arch Surg. 392 (3), 305-314 (2007).
- Condurache, A., Aach, T., Grzybowsky, S., Machens, H. G. Vessel segmentation and analysis in laboratory skin transplant micro-angiograms. Proceedings of the Eighteenth IEEE Symposium on Computer-Based Medical Systems. , 21-26 (2005).
- Danner, S., et al. The use of human sweat gland-derived stem cells for enhancing vascularization during dermal regeneration. Journal of Investigative Dermatology. 132 (6), 1707-1716 (2012).
- Shaterian, A., et al. Real Time Analysis of the Kinetics of Angiogenesis and Vascular Permeability in an Animal Model of Wound Healing. Burns. 35 (6), 811-817 (2009).
- McDonald, D. M., Choyke, P. L. Imaging of angiogenesis: from microscope to clinic. Nature Medicine. 9 (6), 713-725 (2003).
- Bergeron, L., Tang, M., Morris, S. F. A review of vascular injection techniques for the study of perforator flaps. Plastic and Reconstructive Surgery. 117, 2050-2057 (2006).
- Schlatter, P., König, M. F., Karlsson, L. M., Burri, P. H. Quantitative study of intussusceptive capillary growth in the chorioallantoic membrane (CAM) of the chicken embryo. Microvascular Research. 54 (1), 65-73 (1997).
- Lehr, H. A., Leunig, M., Menger, M. D., Nolte, D., Messmer, K. Dorsal skinfold chamber technique for intravital microscopy in nude mice. American Journal of Pathology. 143 (4), 1055-1062 (1993).
- Menger, M. D., Jäger, S., Walter, P., Hammersen, F., Messmer, K. A novel technique for studies on the microvasculature of transplanted islets of Langerhans in vivo. International journal of microcirculation, clinical and experimental. 9 (1), 103-117 (1990).
- Laschke, M. W., et al. Three-dimensional spheroids of adipose-derived mesenchymal stem cells are potent initiators of blood vessel formation in porous polyurethane scaffolds. Acta Biomaterials. 9 (6), 6876-6884 (2013).
- Egaña, J. T., et al. Use of human mesenchymal cells to improve vascularization in a mouse model for scaffold-based dermal regeneration. Tissue Eng Part A. 15 (5), 1191-1200 (2009).
- Condurache, A., Aach, T. Vessel segmentation in angiograms using hysteresis thresholding. Proceedings of the Ninth IAPR Conference on Machine Vision Applications. , 269-272 (2005).
- Egaña, J. T., et al. Ex vivo method to visualize and quantify vascular networks in native and tissue engineered skin. Langenbecks Archives of Surgery. 394, 349-356 (2009).
