Lineage-reprogramação de células pericyte derivados do Adulto Cérebro Humano em neurônios induzidos

Resumo

Segmentação células cerebrais residente linhagem-reprogramação direta oferece novas perspectivas de reparação do cérebro. Aqui nós descrevemos um protocolo de como preparar culturas enriquecido para pericitos cerebrais residente do córtex cerebral humano adulto e convertê-las em neurônios induzidos pela expressão mediada por retrovírus de fatores de transcrição Sox2 e Ascl1.

Resumo

Direto linhagem-reprogramação de células não-neuronais em neurônios induzidos (INS) pode fornecer insights sobre os mecanismos moleculares subjacentes a neurogênese e permitir novas estratégias de modelagem in vitro ou a reparar o cérebro doente. Identificar os tipos de células não-neuronais do cérebro residente passíveis de conversão direta em iNs pode permitir o lançamento de uma tal abordagem in situ, ou seja, dentro do tecido cerebral danificado. Aqui, descrevemos um protocolo desenvolvido na tentativa de identificar células derivadas de cérebro humano adulto que cumprir esta premissa. Este protocolo envolve: (1) a cultura de células humanas a partir do córtex cerebral obtido a partir de biópsias de cérebro humano adulto; (2) a expansão in vitro (aproximadamente exigindo 2-4 semanas) e a caracterização da cultura, por imunocitoquímica e citometria de fluxo; (3) o enriquecimento de células activadas por fluorescência (FACS) utilizando anticorpos anti-PDGF receptor β e os anticorpos anti-CD146;(4) a transdução mediada por retrovírus com a transcrição neurogénica factores sox2 e ascl1; (5) e, finalmente, a caracterização dos neurónios resultantes derivados de pericitos induzidas (PdiNs) por imunocitoquímica (14 dias a 8 semanas após a transdução retroviral). Nesta fase, ins podem ser sondado por suas propriedades elétricas por gravação patch-clamp. Este protocolo fornece um procedimento altamente reprodutível para a conversão linhagem in vitro de pericitos cerebrais residente em iNs humanos funcionais.

Introdução

Ao contrário de reprogramação de células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs), que por sua vez são dotados de uma infinidade de potenciais de diferenciação, reprogramação direta visa a conversão direta de um tipo específico de célula para outra. No que diz respeito à sua aplicação no contexto de modelagem de doenças e terapias baseadas em células potenciais, ambas as abordagens de reprogramação têm vantagens e desvantagens específicas. Reprogramação em iPSCs (i) fornece uma fonte virtualmente infinita de células; (Ii) permite a engenharia genética; (Iii) dota com um potencial de diferenciação quase ilimitada. No entanto, as principais desvantag....

Protocolo

1. Isolamento e cultura de células adultas do cérebro humano

Experimentos envolvendo tecido humano deve ser realizado em conformidade com todas as regulamentações governamentais e institucionais relevantes em relação ao uso de material humano para fins de pesquisa. O presente protocolo foi desenvolvido de acordo com a aprovação do comitê de ética da Faculdade de Medicina da LMU de Munique e consentimento informado por escrito de todos os pacientes.

Este protocolo de preparação de culturas do adulto córtex cerebral humano foi estabelecida utilizando amostras de pacientes de ambos os sexos que sofrem de epilepsia ....

Resultados

O primeiro resultado deste protocolo após o estabelecimento com sucesso de uma cultura a partir de um espécime de adulto humano córtex cerebral consiste na identificação da composição da cultura celular. Imunocitoquímica para as proteínas específicas do tipo de célula, revela um elevado grau de heterogeneidade entre as culturas derivadas de uma amostra de pacientes diferentes (Figura 1A). Quantificada por citometria de fluxo, há sempre uma fracção substancial de células que expressam PDGFRβ (em média ~ .......

Discussão

O presente protocolo descreve a expansão in vitro e de enriquecimento de células derivadas de pericitos após isolamento a partir do córtex cerebral humano adulto e a posterior conversão em iNs por expressão mediada por retrovirus da transcrição neurogénica factores Sox2 e Ascl1. Tal proporciona um protocolo experimental de sistema in vitro para estudar a linhagem de conversão das células cerebrais residente em neurónios e células gliais, também, potencialmente, com o objectivo em mente que em última an.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
anti-CD140b-PE	BD Biosciences	558821	uso 1:100
anti-CD146-FITC	AbD Serotec	MCA2141FT	uso 1:100
anti-CD13-FITC	AbD Serotec	MVA1270A488T	uso 1:100
anti-CD34-APC	BD Biosciences	560940	uso 1:100
anti-PDGFRβ	Sinalização celular	3169S	usa 1:200
anti-CD146	Abcam	Ab75769	usa 1:400
anti-NG2	Millipore	AB5320	usa 1:400
anti-SMA	Sigma-Aldrich	A2547	usa 1:400
anti-β III-tubulina	Sigma-Aldrich	T8660	use 1:400
anti-MAP2	Sigma-Aldrich	M4403	use 1:200
anti-GFAP	Sigma-Aldrich	G3893	use 1:600
anti-GFP	Aves Labs	GFP 10-20	use 1:1.000
anti-RFP	Chromotek	5F8	use 1:500
anti-S100β	Sigma-Aldrich	S2532	usa 1:300
anti-NeuN	Millipore	MAB377	usa 1:200
anti-GABA	Sigma-Aldrich	A2052	usa 1:500
anti-Calretinina	Millipore	AB5054	usa 1:500
anti-vGluT1	SYnaptic SYstems	135511	usam 1:1.000
Controle de isotipo Rat IgG1 FITC	AbD Serotec	11-4301-81	use 1:100
Rat IgG1 controle de isotipo PE	AbD Serotec	12-4301-81	use 1:100
Rat IgG1 controle de isotipo APC	AbD Serotec	17-4301-81	use 1:100
TrypLE	Invitrogen	12605-010
DMEM, glicose alta, GlutaMAX	Invitrogen	61965
B27 suplemento sem soro	Invitrogen
soro fetal de bezerro	Invitrogen	10106-169	realiza inativação de calor por incubação a 56 &graus; C por 30 min
Penicilina-estreptomicina	Invitrogen	15140122
HBSS (Hanks Balanced Salt Solution)	Invitrogen	24020-091
PBS de Dulbecco sem CaCl2 e MgCl2 (D-PBS, 1x)	Invitrogen	14190
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375
Poli-D-lisina bromidrato (PDL)	Sigma-Aldrich	P0899
PFA (paraformaldeído)	Sigma-Aldrich	P1648
Albumina de soro bovino	Sigma-Aldrich	A9418
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T9284
DAPI (4′,6-Diamidin-2-fenilindol) dilactato	Sigma-Aldrich	042M4005
Aqua-Poly/ Tubos	Polysciences	18606-20
	BD Biosciences	352063
Tubos de fundo redondo de poliestireno com tampa de filtro de células	BD Biosciences	352235
Placas de 24 poços	Orange Scientific	5530305
Frascos de cultura de 75 cm2	Greiner Bio-One	658175
frascos de cultura de 25 cm2	Greiner Bio-One	690175
Pipetas descartáveis 10 ml	Sarstedt	86.1254.001
Glass Pasteur pipetas (150 mm)	Fisherbrand	FB50251
Glass coverss 12 mm diameter	Menzel	CB00120RA1
Bisturis cirúrgicos descartáveis	de cultura de	B. Braun
	Greiner Bio-One	633180
Tubos cônicos 15 ml	BD Biosciences	352095
Capuz
Centrífuga e rotor basculante com adaptadores para tubos de 15 ml e 50 ml	Hettich Lab Technology	1406
Classificador de células de citometria de fluxo: FACSAria l com software FACSDiva	BD Biosciences
Incubadora de cultura de células humificadas	Eppendorf Galaxy 170R
Banho de água a 37 ° C
FACSFado da bainha de baixo	BD Biosciences	342003
Microscópio de epifluorescência BX61	Microscópio confocal Olympus
LSM710	Zeiss

17504044 de fundo redondo de polipropileno Mount Placas tecidos 5518083 de fluxo laminar