Undersøgelse af protein-protein interaktioner i levende celler Brug Bioluminescens Resonance Energy Transfer

Summary

Interaktioner mellem proteiner er grundlæggende for alle cellulære processer. Brug Bioluminescens Resonance Energy Transfer, kan overvåges interaktionen mellem et par af proteiner i levende celler og i realtid. Endvidere kan virkningerne af potentielt patogene mutationer vurderes.

Abstract

Analyser baseret på Bioluminescens Resonance Energy Transfer (BRET) give en følsom og pålidelig måde at overvåge protein-protein interaktioner i levende celler. BRET er den ikke-radiative overførsel af energi fra en "donor" luciferaseenzym til en "acceptor" fluorescerende protein. I den mest almindelige konfiguration af dette assay donoren Renilla R. reniformis luciferase og acceptoren er gult fluorescerende protein (YFP). Da effektiviteten af ​​energioverførsel er stærkt afstand-afhængig, observation af BRET fænomen kræver, at donor og acceptor være i tæt nærhed. For at teste for en interaktion mellem to proteiner af interesse i dyrkede pattedyrceller, er et protein, der udtrykkes som en fusion med luciferase og den anden som en fusion med YFP. En interaktion mellem de to proteiner af interesse kan bringe donor og acceptor tilstrækkelig tæt til energioverførsel at forekomme. Sammenlignet med andre teknikker til at undersøge protein-protein iteractions, den BRET analysen er følsom, kræver lidt hands-on tid og få reagenser, og er i stand til at detektere interaktioner, som er svage, forbigående, eller afhængig af den biokemiske miljø findes inden for en levende celle. Det er derfor en ideel metode til bekræftelse af formodede interaktioner foreslået af gær to-hybrid-eller massespektrometri proteomics undersøgelser, og derudover er det velegnet til kortlægning interagerende regioner, vurdere effekten af ​​post-translationelle modifikationer på protein-protein interaktioner, og evaluere virkningen af ​​mutationer identificeret i patientens DNA.

Introduction

Både klassisk kobling og næste generation sekventering analyser af menneskelige lidelser er afslørende den kliniske relevans af proteiner involveret i en række biologiske veje. Det er ofte tilfældet, at forud for deres identifikation i sådanne undersøgelser, har der været lidt eller ingen undersøgelse af den biologiske rolle af disse proteiner. En frugtbar vej til at begynde at udforske den biologiske funktion af et protein af interesse er at identificere, hvilke andre proteiner, det interagerer med i sin fysiologiske sammenhæng. Karakterisere molekylære netværk på denne måde giver indsigt i de biologiske veje ligger til grund for menneskelig fænotype.

Den hyppigst anvendte storstilet screening tilgange til at identificere kandidat interaktion partnere for proteiner af interesse er gær to-hybrid screening ¹ og massespektrometri-baserede proteomics ^2. Disse metoder kan være meget vellykket i at foreslå potentielle interagerende proteiner, men are sårbar over for falske positive resultater. Derfor bekræftelse af en vekselvirkning identificeret af gær to-hybrid-eller massespektrometri screening kræver validering af interaktionen ved hjælp af en anden teknik. Typisk en co-immunopræcipitation eller pull-down assay anvendes til dette formål ^3. En ulempe ved anvendelse af sådanne teknikker til validering er kravet om cellelyse, som ødelægger de intracellulære betingelser, der kan være afgørende for at opretholde visse protein-interaktioner. En anden ulempe er, at svage eller forbigående protein-interaktioner kan forstyrres under vasketrin. Desuden kræver disse analyser betydelige hands-on tid, er begrænset i antallet af prøver, der kan behandles samtidigt, og kræver ofte tidskrævende optimering af reagenser og protokoller.

For at overvinde nogle af de problemer, der er forbundet med co-immunpræcipitationseksperimenter har flere assays blevet udviklet baseret på fluorescerende og bioluminescent proteiner, der kan anvendes i levende celler. De første af disse assays blev baseret på fluorescens (eller Forster) Resonance Energy Transfer (FRET), den ikke-radiative overførsel af energi mellem to fluorescerende proteiner med overlappende emissions-og excitationsspektre ^4. Effektiviteten af ​​energioverførsel er stærkt afstand afhængig af, derfor observation af FRET fænomen kræver, at donor-og acceptor fluorophores være i tæt nærhed. For at teste for en interaktion mellem to proteiner af interesse, er et protein, der udtrykkes som en fusion med donorfluorophor (almindeligvis cyan fluorescerende protein; FFP) og den anden som en fusion med acceptorfluoroforen (almindeligvis gult fluorescerende protein; YFP). En interaktion mellem de to proteiner af interesse kan bringe donor-og acceptor-fluoroforer tilstrækkelig tæt til energioverførsel at forekomme, hvilket vil resultere i en målelig forøgelse i emissionen af ​​lys fra YFP acceptoren i forhold til donor FFP. FRET har været en succes i forbindelse med afsløring af protein-protein interaktioner i levende celler ^4. Den største ulempe ved anvendelse af FRET til påvisning af protein-protein interaktioner er kravet om ekstern belysning til excitation af donorfluoroforen. Eksterne resultater belysning i høj baggrund i udledningen signal, uønsket excitation af acceptor, og fotoblegning af både donor og acceptor fluorophores. Disse virkninger reducere følsomheden af ​​assayet til påvisning af protein-protein interaktioner.

En modifikation af FRET-assay, der overvinder problemet med høj baggrund fra ekstern belysning er Bioluminescens Resonance Energy Transfer (BRET)-assay ^5,6. I BRET systemet donorfluoroforen er erstattet af et luciferaseenzym. Således energi til excitation af acceptoren fluorofor genereres i systemet ved oxidation af et luciferasesubstrat, rendering ekstern belysning unødvendig. I de mestfælles konfiguration af denne analyse, donor er Renilla reniformis luciferase og acceptor er YFP (for en diskussion af alternativ donor og acceptor proteiner se Pfleger et al. ^5). Derfor i dette system, er et protein af interesse er fusioneret til luciferase og et potentielt interagerende protein til YFP, eller omvendt. Den BRET analysen kræver tilsætning af coelenterazin som et substrat for luciferase. Fordi coelenterazin er celle-permeabel, er det muligt at udføre BRET assays levende celler. Men native coelenterazin er ustabilt i vandig opløsning, og enzym-uafhængig fordeling af coelenterazin både reducerer koncentrationen af ​​substratet til rådighed for analysen og genererer autoluminescence, hvilket reducerer følsomheden af ​​målinger af luciferaseaktivitet. Brugen af ​​BRET i levende celler er blevet fremmet af udviklingen af ​​beskyttede coelenterazines, som er stabile i vandig opløsning, men spaltes af cytosol esterases efter diffusion over cellemembranen til at generere aktive coelenterazin i cellen ^7.

Efter tilsætning af substrat til celler, som udtrykker luciferase-og YFP-fusionsproteiner, er energioverførsel som følge af protein-protein interaktioner kvantificeres ved at overvåge emission fra luciferase og YFP. Fordi protein interaktioner kan overvåges direkte i levende celler i flere brønde, den BRET analysen udgør en enkel, skalerbar metode til validering af formodede interaktioner, der er omkostnings-og tidsbesparende.

Ud over at validere putative interaktionskandidater identificeret i proteom screening undersøgelser kan BRET systemet også bruges til at teste interaktionskandidater følger kendte biokemiske og strukturelle undersøgelser af proteinet af interesse. Når forekomsten af ​​en protein-protein interaktion er blevet etableret (enten ved at bruge BRET analysen eller ved andre teknikker), der er potentiale for BRET assay at være employed yderligere at karakterisere interaktion. For eksempel kan de interagerende regioner kortlægges ved at generere afkortede versioner af proteiner, og inddragelse af specifikke rester i samspillet kan påvises ved at skabe punktmutationer. Endvidere kan modulerende virkning af posttranslationelle modifikationer eller små molekyler (såsom lægemidler eller ligander) på protein-protein interaktioner undersøges ^8-10.

Den BRET analyse har også et stort potentiale for at undersøge mutationer identificeret i patientens DNA. I tilfælde, hvor en sygdomsfremkaldende rolle for en mutation er blevet etableret, studere effekten af mutationen på protein-protein interaktioner ved hjælp BRET kan afsløre mere om den molekylære ætiologi fænotype ^11. Siden indførelsen af ​​næste generation sekventering metoder, er det mere almindeligt, at flere potentielt skadelige mutationer skal identificeres inden for et individ, i hvilket tilfælde det er uklart, som er relevante for fænotype ^12. I denne situation BRET analysen kan være værdifulde i at evaluere effekten af ​​mutationer på protein funktion og dermed deres relevans for uorden.

Protocol

1.. Oprettelse af plasmider Subklone cDNA'er for hvert protein af interesse i både pLuc og pYFP vektorer ved anvendelse af standard molekylærbiologiske teknikker (figur 1). For detaljerede protokoller se Green et al 13. Sequence alle konstruktioner at kontrollere, at proteiner af interesse er i ramme med Luc / YFP sekvens uden nogen mellemliggende stopcodons. Udfør funktionelle assays som ønsket for at bekræfte, at fusionsproteinerne bevarer bi…

Representative Results

Princippet i BRET assay er illustreret i fig. 2. Assay opsætning anvendes i eksperimenterne præsenteret her er afbildet i fig. 3. Påvisningen af et stærkt BRET signal fra celler transfekteret med et luciferase-YFP fusionsprotein bekræftede, at energioverførsel var observerbare i denne forsøgsopstilling (figur 4). Vores forskning fokuserer på den rolle, FOXP familien transkriptionelle repressorer i hjernens udvikling. Heterozygote mut…

Discussion

Udformningen af ​​fusionsproteinekspression konstruktioner er et afgørende skridt i oprettelsen af ​​BRET analysen. I eksperimenterne præsenteret her blev proteinerne af interesse fusioneret til den C-terminale ende af luciferase eller YFP. Det er også muligt, og kan være nødvendig for at smelte proteiner til den N-terminale ende af luciferase / YFP. For nogle proteiner kan fusioner kun blive accepteret på enten N-eller C-terminalen for at undgå forstyrrelse af proteiners struktur og funktion. Endvidere e…

Materials

Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96 microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.