Undersökning av protein-proteininteraktioner i levande celler med hjälp Bioluminescence Resonance Energy Transfer

Summary

Interaktioner mellan proteiner är grundläggande för alla cellulära processer. Använda Bioluminescence Resonance Energy Transfer, kan interaktionen mellan ett par av proteiner följas i levande celler och i realtid. Vidare kan effekterna av potentiellt patogena mutationer bedömas.

Abstract

Analyser baserade på Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) ger en känslig och tillförlitligt sätt att övervaka protein-proteininteraktioner i levande celler. BRET är den icke-strålningstransport av energi från en "givare" luciferas enzym till en "acceptor" fluorescerande protein. I den vanligaste konfigurationen för denna analys, är givare Renilla reniformis-luciferas och acceptorn är gul fluorescerande protein (YFP). Eftersom effektiviteten i energiöverföring är starkt avståndsberoende, kräver observation av BRET fenomenet att givaren och mottagaren vara i närheten. För att testa en interaktion mellan två proteiner av intresse i odlade däggdjursceller, är ett protein uttrycks som en fusion med luciferas och den andra som en fusion med YFP. En interaktion mellan de två proteiner av intresse kan föra givaren och acceptorn är tillräckligt nära för att energiöverföring skall ske. Jämfört med andra tekniker för att undersöka protein-protein iteractions, den BRET-analysen är känslig, kräver lite praktisk tid och några reagenser, och kan upptäcka interaktioner som är svag, övergående, eller beroende av den biokemiska miljön finns inom en levande cell. Det är därför en idealisk metod för att bekräfta förmodade interaktioner föreslagits av jäst två-hybrid eller masspektrometri proteomik studier, och dessutom är väl lämpad för kartläggning samverkande regionerna, att bedöma effekten av posttranslationella modifieringar på protein-proteininteraktioner, och utvärdera effekten av mutationer som identifierats i patientens DNA.

Introduction

Både klassisk koppling och nästa generations sekvensering analyser av mänskliga sjukdomar avslöjar den kliniska relevansen av proteiner involverade i en rad biologiska banor. Det är ofta så att, före deras identifiering i sådana studier, har det varit lite eller ingen undersökning av den biologiska rollen av dessa proteiner. En fruktbar väg att börja utforska den biologiska funktionen hos ett protein av intresse är att identifiera vilka andra proteiner det interagerar med i dess fysiologiska sammanhang. Karakterisera molekylära nätverk på detta sätt ger insikter i de biologiska mekanismer som ligger bakom människans fenotyp.

Den mest använda storskalig screening metoder för att identifiera kandidatinteraktionspartner för proteiner av intresse är jäst två-hybrid screening ¹ och masspektrometri-baserad proteomik ^2. Dessa metoder kan vara mycket framgångsrik i att föreslå potentiella interagerande proteiner, men are utsatta för falska positiva resultat. Därför är en bekräftelse på en interaktion identifieras av jäst två-hybrid eller masspektrometri screening kräver validering av interaktionen med hjälp av en annan metod. Typiskt en co-immunoprecipitation eller pull-down-analysen används för detta ändamål ^3. En nackdel med att använda sådana tekniker för validering är kravet för cellys, vilket förstör de intracellulära förhållanden som kan vara nödvändigt för att hålla vissa proteininteraktioner. En andra nackdel är att svaga eller transienta proteininteraktioner kan störas under tvättningsstegen. Dessutom är dessa analyser kräver betydande praktisk tid, är begränsade i antalet prover som kan behandlas samtidigt, och kräver ofta tidskrävande optimering av reagenser och protokoll.

För att övervinna några av de problem som är förknippade med co-immunoprecipitation experiment har flera tester utvecklats baserat på fluorescerande och bioluminescent proteiner som kan användas i levande celler. De första analyserna var baserade på fluorescens (eller Förster) resonansenergiöverföring (FRET), den icke-strålande energiöverföring mellan två fluorescerande proteiner med överlappande emissions-och exciteringsspektra ^4. Effektiviteten för energiöverföring är starkt avståndsberoende därför observation av FRET-fenomen kräver att donator-och acceptor-fluoroforer vara i omedelbar närhet. För att testa med avseende på en interaktion mellan två proteiner av intresse, är ett protein som uttrycks som en fusion med donatorfluoroforen (vanligen cyan fluorescent protein, GFP) och den andra som en fusion med acceptorfluoroforen (vanligen gul fluorescerande protein; YFP). En interaktion mellan de två proteiner av intresse kan föra donator och acceptor fluoroforer tillräckligt nära för energiöverföring att ske, vilket kommer att leda till en mätbar ökning av utsläpp av ljuset från YFP acceptor i förhållande till den gemensamma fiskeripolitiken donatorn. FRET har varit framgångsrik i att upptäcka protein-proteininteraktioner i levande celler ^4. Den huvudsakliga nackdelen med användning av FRET för att detektera protein-proteininteraktioner är kravet på extern belysning för excitering av donatorfluoroforen. Ytterbelysning ger hög bakgrund i emissionssignalen, oönskad excitation av acceptor, och fotoblekning för både givare och acceptor fluoroforer. Dessa effekter minskar känsligheten hos analysen för att detektera protein-proteininteraktioner.

En modifiering av FRET-assay, som övervinner problemet med höga bakgrunden från ytterbelysning är Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET)-analys ^5,6. I BRET systemet donatorfluoroforen är ersatt med en luciferas-enzymet. Sålunda energin för exciteringen av acceptorfluoroforen alstras inom systemet genom oxidation av ett luciferas-substrat, vilket gör ytterbelysning onödig. I den mestvanlig konfiguration av denna analys, som är givare Renilla reniformis-luciferas och acceptorn är YFP (för en diskussion av alternativa donator-och acceptor-proteiner se Pfleger et al. ^5). Följaktligen, i detta system är ett protein av intresse smält till luciferas och ett potentiellt interagerande protein till YFP, eller vice versa. Den BRET-analysen kräver tillsats av coelenterazine som substrat för luciferas. Eftersom coelenterazin är cell-permeabel, är det möjligt att utföra BRET analyser i levande celler. Emellertid är nativt coelenterazine instabil i vattenlösning, och enzymet oberoende uppdelning av coelenterazin både reducerar koncentrationen av substratet tillgängligt för analysen och genererar autoluminescence, vilket minskar känsligheten hos mätningar av luciferasaktivitet. Användningen av BRET i levande celler har underlättats genom utvecklingen av skyddade coelenterazines, vilka är stabila i vattenlösning men klyvs av cytosolisk esterass efter diffusion över cellmembranet för att generera aktiv coelenterazine inuti cellen ^7.

Efter tillsats av substrat till celler som uttrycker luciferas-och YFP-fusionsproteiner, är energiöverföringen till följd av protein-proteininteraktioner kvantifierades genom övervakning av utsläpp från luciferas och YFP. Eftersom proteininteraktioner kan övervakas direkt i levande celler i flerbrunnsplattor, utgör BRET-analysen en enkel, skalbar metod för validering förmodade interaktioner som är kostnads-och tidseffektivt.

Förutom att validera förmodade interactmedlemmar identifierats i proteomic screeningstudier kan BRET systemet också användas för att testa kandidatinteragerande som härrör från tidigare kända biokemiska och strukturella studier av proteinet av intresse. Så snart det finns en protein-proteininteraktion har fastställts (antingen genom att använda BRET analysen eller genom andra tekniker), det finns potential för BRET analysen för att vara anstlegerade ytterligare karaktärisera interaktionen. Till exempel kan de samverkande regionerna kartläggas genom att generera stympade versioner av proteinerna, och medverkan av specifika rester i interaktionen kan visas genom att skapa punktmutationer. Vidare kan den modulerande effekten av posttranslationella modifieringar eller små molekyler (såsom läkemedel eller ligander) på protein-proteininteraktioner undersökas ^8-10.

Den BRET-analysen har också stora möjligheter att utreda mutationer som identifierats i patientens DNA. I fall där en orsakande roll för en mutation har fastställts, att studera effekten av mutationen på protein-protein-interaktioner med användning BRET kan avslöja mer om den molekylära etiologin av fenotypen ^11. Sedan tillkomsten av nästa generations sekvenseringsmetoder, är det allt vanligare att flera potentiellt skadliga mutationer kan identifieras inom en individ, i vilket fall det är oklart vilka är relevantavanta till fenotypen ^12. I denna situation BRET analysen kan vara värdefullt för att utvärdera effekten av mutationer på proteiners funktion och därmed deras relevans för sjukdom.

Protocol

1. Skapande av plasmider Subklona cDNA för varje protein av intresse i både de pLuc och pYFP vektorerna, med hjälp av standardmässiga molekylärbiologiska tekniker (Figur 1). För detaljerade protokoll se Green m.fl. 13. Sekvens alla konstruktioner för att kontrollera att de proteiner av intresse är i ram med Luc / YFP sekvens utan några mellanliggande stoppkodoner. Utför funktionella analyser som önskas för att bekräfta att fusionsproteinern…

Representative Results

Principen för BRET analysen illustreras i figur 2. Analysen inställnings använts genom experiment som presenteras här är avbildad i figur 3. Detekteringen av en stark BRET signalen från celler som transfekterats med en luciferas-YFP fusionsproteinet bekräftades att energiöverföring kunde observeras i denna experimentuppställning (Figur 4). Vår forskning fokuserar på den roll som FOXP familj av transkriptions repressors i hjärnan…

Discussion

Utformningen av fusionsproteinexpressionskonstruktionerna är ett kritiskt steg i upprättandet av BRET analysen. I de experiment som presenteras här var de proteiner av intresse smält till C-änden av luciferas eller YFP. Det är även möjligt, och kan vara nödvändigt, för att sammansmälta proteiner till N-terminus av luciferas / YFP. För vissa proteiner kan fusioner accepteras endast på antingen N-eller C-terminalen för att undvika avbrott i proteiners struktur och funktion. Dessutom, för transmembranprotei…

Materials

Nanodrop 8000	Nanodrop		Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes.
96 microwell plates, flat bottom, white	Greiner Bio One	655098	White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off.
Infinite F200Pro plate reader with control software	TECAN		Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable.
pLuc, pYFP, positive control plasmid	N/A	N/A	Plasmids available from the authors upon request.
pGEM-3Zf(+)	Promega	P2271	Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable.
HEK293 cells	ECACC	85120602	Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable.
DMEM, high glucose, with phenol red	Gibco	41966	This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium.
DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium)	Gibco	21063	This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use.
OptiMEM	Gibco	31985	OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use.
Fetal bovine serum	Gibco	10270	For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v.
GeneJuice transfection reagent	Novagen	70967	If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions.
DMSO	Sigma	D2650	Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture.
EnduRen live-cell substrate	Promega	E6481	Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium.