Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi kullanma Canlı Hücrelerde Protein-protein etkileşimleri araştıran
Summary
Proteinler arasındaki etkileşimleri tüm hücresel süreçleri için temel vardır. Bio-ışıldama, rezonans enerji transferi kullanılarak, proteinlerin bir çift arasındaki etkileşim, canlı hücrelerde ve gerçek zamanlı olarak izlenebilir. Bundan başka, potansiyel olarak patojenik mutasyonların etkisi değerlendirilebilir.
Abstract
Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) dayalı tahliller, canlı hücrelerde protein-protein etkileşimleri izlemek için bir hassas ve güvenilir bir araç sağlar. BRET bir "alıcı" flüoresan protein için bir 'verici' lusiferaz enzim enerji radyatif olmayan transferidir. Bu deneyde en yaygın yapılandırmada, verici Renilla reniformis'e lusiferaz ve alıcı sarı floresan proteini (YFP) 'dir. Enerji transferi verimi güçlü mesafe bağımlı olduğu için, BRET olgusunun gözlem verici ve alıcı yakın olması gerekir. Kültürlenen memeli hücrelerde ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim için test etmek amacıyla, protein, bir lusiferaz ve YFP ile bir füzyon olarak, ikincisi ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim verici ve enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın akseptörü getirebilir. Protein-protein araştırmak için başka teknikler ile karşılaştırıldığındateractions, Bret tahlil duyarlı, küçük ellerini-zaman ve kaç reaktifler gerektirir, ve, zayıf geçici, ya da canlı bir hücrenin içinde bulunan biyokimyasal çevresine bağlıdır etkileşimleri tespit edebiliyor. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrofotometresi proteomik çalışmalar önerdiği varsayımsal etkileşimleri doğrulanması için ideal bir yaklaşımdır, ve ek olarak protein-protein etkileşimleri, çevirim sonrası değişikliklerin etkisini değerlendirmek, eşleme etkileşim bölgeleri için çok uygundur, ve Hasta DNA tanımlanan mutasyonların etkisini değerlendirmek.
Introduction
Dizileme insan bozuklukları arasında bağlantı analizleri klasik ve yeni nesil Hem biyolojik yolların bir aralıkta yer alan proteinlerin klinik anlam açıklayıcıdır. Bu önce bu tür çalışmalarda kendi tanımlama, bu proteinlerin biyolojik rolünün çok az veya hiç soruşturma edildiğine, genellikle böyledir. Ilgi konusu bir proteinin biyolojik fonksiyonunu keşfetmek başlatmak için verimli bir yol onun fizyolojik bağlamında ile etkileşen diğer hangi proteinlerin tespit etmektir. Bu şekilde moleküler ağlar karakterize insan fenotip altında yatan biyolojik yollar içgörüler sağlar.
En sık kullanılan büyük ölçekli tarama ilgi konusu olan proteinlerin aday etkileşim ortakları belirlenmesi için yaklaşımlar maya iki-hibrid eleme 1 ve kütle spektrometresi tabanlı proteomik 2 'dir. Bu yöntemler potansiyel etkileşim proteinler düşündüren çok başarılı olabilir, ancak ar olabilirYanlış pozitif sonuçlar savunmasız e. Bu nedenle, maya iki-melez ya da kütle spektrometrisi tarama ile belirlenen bir etkileşim onay ikinci bir teknik kullanılarak etkileşim doğrulaması gerektirmektedir. Tipik olarak, bir ko-immünopresipitasyon veya çekme-down deney bu amaçla 3 için kullanılır. Doğrulama için bu gibi teknikler kullanılarak bir dezavantajı, belirli bir protein etkileşimlerini muhafaza edilmesi için gerekli olabilir, hücre içi koşullar yok hücre lisisi, için bir gerekliliktir. İkinci bir dezavantaj, zayıf ya da geçici protein etkileşimleri yıkama adımları sırasında bozulabilir olmasıdır. Ayrıca, bu deneyler, önemli eller zaman talep aynı anda işlenebilir numune sayısı sınırlıdır ve genellikle reaktiflerin ve protokoller zaman alıcı optimizasyon gerektirir.
Ko-immünopresipitasyon deneyleri ile ilişkili problemlerin bazılarının üstesinden gelebilmek için, çeşitli tahliller, floresan ve biolum göre geliştirilmiştircanlı hücreler olarak kullanılabilir inescent proteinleri. Bu alandaki ilk deneyler Floresans (veya Förster) rezonans enerji transferi (FRET), üst üste binen emisyon ve uyarım spektrumları 4, iki floresan protein arasındaki enerji radyatif olmayan transferi dayandırılmıştır. Enerji transferi etkinliği bu nedenle, FRET olgusunun gözlem verici ve alıcı floroforlar yakın olması gerekir, güçlü bir mesafe bağımlıdır. Ve akseptör-floroforu (yaygın sarı floresan proteini; YFP) ile bir füzyon olarak ikinci, ilgi iki protein arasındaki bir etkileşim test etmek için, bir protein, donor-florofor (CFP genel olarak mavi floresan protein) ile bir füzyon olarak ifade edilir. Ilgilenilen iki protein arasında bir etkileşim CFP donör YFP akseptör göreceli ışık emisyon ölçülebilir bir artışa neden olur ki, enerji transferi oluşabilmesi için yeterince yakın bir verici ve alıcı florofor getirebilir. FRET canlı hücreler 4 protein-protein etkileşimlerini tespit başarılı olmuştur. Protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için FRET kullanılmasının başlıca dezavantajı, donor-florofor uyarma dış aydınlatma için bir gerekliliktir. Emisyon sinyali, alıcı istenmeyen uyarma ve verici ve alıcı florofor hem ışıkla ağartma yüksek arka dış aydınlatma sonuçlanır. Bu etkiler, protein-protein etkileşimlerini tespit etmek için, tahlilin hassasiyetini azaltır.
Dış aydınlatma yüksek bir arka plan sorununu ortadan FRET deneyinin bir modifikasyonu Bio-ışıldama Rezonans Enerji Transferi (BRET) tahlili 5,6 olan. BRET sisteminde donor-floroforu bir lusiferaz enzimi ile değiştirilir. Bu durumda, alıcı fluorofor uyarılması için enerji gereksiz dış aydınlatma ile, bir lusiferaz alt-tabakanın oksidasyonu ile, sistem içinde oluşturulur. ÇoğundaBu tahlilin ortak bir yapılandırma, verici Renilla lusiferaz reniformis ve akseptör (alternatif donör ve akseptör proteinlere ilişkin bir tartışma için Pfleger et al. bakınız: 5) YFP olmasıdır. Bu duruma göre, bu sistemde, ilgi konusu bir protein lusiferaz ve potansiyel olarak etkileşen protein YFP için, veya tam tersi kaynaşır. BRET deney lusiferaz için bir substrat olarak koelenterazin eklenmesini gerektirir. Coelenterazine hücre-geçirgen olduğu için, canlı hücrelerde BRET deneyleri gerçekleştirmek mümkündür. Bununla birlikte, doğal coelenterazine sulu çözelti içinde kararsız olduğu ve koelenterazin enzim bağımsız arıza tahlil için alt-tabaka mevcut konsantrasyonunu azaltır ve lusiferaz aktivitesi ölçümlerinin hassasiyetini azaltır autoluminescence oluşturur, her ikisi de. Canlı hücrelerdeki BRET kullanılması, sulu çözelti içinde stabil olan, ancak sitosolik esteraz ile bölünen korunan coelenterazines, geliştirilmesi ile kolaylaştırılmıştırhücre 7 içindeki aktif coelenterazine oluşturmak için hücre zarından difüzyon sonra s.
Lusiferazı ve YFP-füzyon proteinlerini eksprese eden hücrelere substrat ilave edildikten sonra, protein-protein etkileşimleri kaynaklanan enerji transferi lusiferaz ve YFP gelen emisyon izleyerek ölçülür. Protein etkileşimleri, çok oyuklu plakalar içerisinde canlı hücreler doğrudan izlenebilir için, BRET deney maliyet ve zaman tasarruflu, varsayılan etkileşimlerini doğrulamak için basit bir ölçeklenebilir bir yöntem içerir.
Proteomik tarama çalışmalarda tanımlanan varsayılan inter aktörlerin onaylamaya ek olarak, BRET sistem aynı zamanda, ilgi konusu bir protein üzerinde önceden biyokimyasal ve yapısal çalışmalarından gelen test aday uygulayıcı için kullanılabilir. , Bir protein-protein etkileşiminin varlığı (BRET yöntemi kullanılarak ya da diğer teknikler yoluyla) bir kez kurulduktan sonra BRET deney emp olması için potansiyel vardırloyed ayrıca etkileşimlerini karakterize etmek için. Örneğin, etkileşim bölgeleri proteinlerinin kesilmiş versiyonları üreterek eşlenebilir ve bu etkileşimde belirli tortuların katılımı nokta mutasyonlar oluşturarak kanıtlanabilir. Ayrıca, protein-protein etkileşimleri ile ilgili çevrim sonrası modifikasyon veya (ilaç veya ligandlar gibi) küçük moleküller modüle edici etkisinin 8-10 araştırılabilir.
Tahlil, aynı zamanda, hasta BRET DNA tanımlanan mutasyonlar araştırmak için büyük bir potansiyele sahiptir. Durumda, bir mutasyon için nedensel rol BRET fenotip 11 moleküler etiyolojisi hakkında daha fazla ortaya çıkarabilir kullanılarak protein-protein etkileşimlerine mutasyonun etkisi araştırılarak kurulmuştur burada. Çeşitli potansiyel olarak zarar veren mutasyonların rele olduğu açık değildir, bu durumda, bir birey içinde tespit edilmesi için yeni nesil dizileme yöntemleri gelişiyle bu yana, giderek daha yaygın olduğufenotip 12 adjuvant. Bu durumda BRET deney protein işlevi üzerindeki mutasyonlar etkisini değerlendirmek için de değerlidir ve bozukluğa dolayısıyla alaka olabilir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Füzyon protein ekspresyon yapılarının tasarımı Bret tahlil kurma önemli bir adımdır. Burada yer alan deneylerde, ilgi duyulan proteinlerin veya lusiferaz YFP C-terminine kaynaştırılmıştır. De mümkündür, ve lusiferaz / YFP N-terminine proteinleri sigorta, gerekli olabilir. Bazı proteinler için, füzyonları, sadece protein yapısı ve işlevinin bozulmasını önlemek için N-veya C-terminalinde ya da kabul edilebilir. Ayrıca, zar proteinleri olarak N ve C termini lusiferaz / YFP protein etkileşim o…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu çalışma Max Planck Derneği tarafından desteklenmiştir.
Materials
| Nanodrop 8000 | Nanodrop | Any spectrophotometer capable of reading absorbances at 260 nm will be suitable. Determining the molecular mass of the plasmid is crucial for calculating DNA quantities to be used in transfection mixes. | |
| 96 microwell plates, flat bottom, white | Greiner Bio One | 655098 | White plates reduce the crosstalk between wells and maximize the sensitivity of luminescence detection. Clear-bottomed wells allow monitoring of cell density. Plates must be suitable for cell culture. If using a top-reading luminometer the plate lid should be taken off. |
| Infinite F200Pro plate reader with control software | TECAN | Use the 'Blue 1' and 'Green 1' filters for luminescence measurement and the filter sets and dichoic mirror for GFP for fluorescence measurement. Any top-reading plate reader with capability of measuring dual-color luminescence and fluorescence is suitable. | |
| pLuc, pYFP, positive control plasmid | N/A | N/A | Plasmids available from the authors upon request. |
| pGEM-3Zf(+) | Promega | P2271 | Filler plasmid for equilization of DNA mass in transfection mixes. Any plasmid lacking a eukaryotic promoter would be suitable. |
| HEK293 cells | ECACC | 85120602 | Other cell lines that transfect with reasonable efficiency may be suitable. |
| DMEM, high glucose, with phenol red | Gibco | 41966 | This is the medium used for culturing HEK293 cells. Warm in 37 °C waterbath before use. If using a different cell line, replace the growth medium described here with cell-line specific medium. |
| DMEM, high glucose, no phenol red (substrate dilution medium) | Gibco | 21063 | This is the substrate dilution medium used for dilution of the luciferase substrate (EnduRen) as it does not contain phenol red, which reduces the sensitivity of the assay. Contains HEPES to maintain correct pH during luminescence measurements while cells are out of the CO2 incubator. Warm in 37 °C waterbath before use. |
| OptiMEM | Gibco | 31985 | OptiMEM is used for dilution of GeneJuice transfection reagent. Other serum-free media would also be suitable. Warm to room temperature before use. |
| Fetal bovine serum | Gibco | 10270 | For supplementation of cell culture media at a concentration of 10% v/v. |
| GeneJuice transfection reagent | Novagen | 70967 | If using a cell line other than HEK293, it may be necessary to adjust the ratio of Genejuice transfection reagent to DNA in the transfection mixes. Other transfection reagents may be used. If using an alternative transfection reagent, it may be necessary to optimize the amount of DNA used in the transfection mixes based on manufacturer's instructions. |
| DMSO | Sigma | D2650 | Use sterile DMSO that is suitable for tissue culture. |
| EnduRen live-cell substrate | Promega | E6481 | Reconstitute EnduRen at 34 mg/ml in DMSO. Upon dilution of EnduRen in culture medium a precipitate may form. This will not interfere with the assay. Store reconstituted EnduRen at -20 °C, and avoid multiple freeze-thaw cycles. Ensure that reconstituted EnduRen is completely thawed before diluting it in culture medium. |
Referências
- Suter, B., Kittanakom, S., Stagljar, I. Two-hybrid technologies in proteomics research. Curr Opin Biotechnol. 19, 316-323 (2008).
- Gingras, A. C., Gstaiger, M., Raught, B., Aebersold, R. Analysis of protein complexes using mass spectrometry. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 645-654 (2007).
- Berggard, T., Linse, S., James, P. Methods for the detection and analysis of protein-protein interactions. Proteomics. 7, 2833-2842 (2007).
- Ciruela, F. Fluorescence-based methods in the study of protein-protein interactions in living cells. Curr Opin Biotechnol. 19, 338-343 (2008).
- Pfleger, K. D., Eidne, K. A. Illuminating insights into protein-protein interactions using bioluminescence resonance energy transfer. BRET). Nat Methods. 3, 165-174 (2006).
- Boute, N., Jockers, R., Issad, T. The use of resonance energy transfer in high-throughput screening. BRET versus FRET. Trends Pharmacol Sci. 23, 351-354 (2002).
- Pfleger, K. D., et al. Extended bioluminescence resonance energy transfer (eBRET) for monitoring prolonged protein-protein interactions in live cells. Cell Signal. 18, 1664-1670 (2006).
- Kocan, M., Dalrymple, M., Seeber, R., Feldman, B., Pfleger, K. Enhanced BRET technology for the monitoring of agonist-induced and agonist-independent interactions between GPCRs and β-arrestins. Frontiers in Endocrinology. 1, (2011).
- Boute, N., Pernet, K., Issad, T. Monitoring the activation state of the insulin receptor using bioluminescence resonance energy transfer. Mol Pharmacol. 60, 640-645 (2001).
- Perroy, J., Pontier, S., Charest, P. G., Aubry, M., Bouvier, M. Real-time monitoring of ubiquitination in living cells by BRET. Nat Methods. 1, 203-208 (2004).
- Roduit, R., Escher, P., Schorderet, D. F. Mutations in the DNA-binding domain of NR2E3 affect in vivo dimerization and interaction with CRX. PLoS One. 4, (2009).
- Deriziotis, P., Fisher, S. E. Neurogenomics of speech and language disorders: the road ahead. Genome Biol. 14, 204 (2013).
- Green, M. R., Sambrook, J. . Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , (2012).
- Lai, C. S., Fisher, S. E., Hurst, J. A., Vargha-Khadem, F., Monaco, A. P. A forkhead-domain gene is mutated in a severe speech and language disorder. Nature. 413, 519-523 (2001).
- Fisher, S. E., Scharff, C. FOXP2 as a molecular window into speech and language. Trends Genet. 25, 166-177 (2009).
- Graham, S. A., Fisher, S. E. Decoding the genetics of speech and language. Curr Opin Neurobiol. 23, 43-51 (2013).
- O’Roak, B. J., et al. Exome sequencing in sporadic autism spectrum disorders identifies severe de novo mutations. Nat Genet. 43, 585-589 (2011).
- Horn, D., et al. Identification of FOXP1 deletions in three unrelated patients with mental retardation and significant speech and language deficits. Hum Mutat. 31, 1851-1860 (2010).
- Hamdan, F. F., et al. De novo mutations in FOXP1 in cases with intellectual disability, autism, and language impairment. Am J Hum Genet. 87, 671-678 (2010).
- Talkowski, M. E., et al. Sequencing chromosomal abnormalities reveals neurodevelopmental loci that confer risk across diagnostic boundaries. Cell. 149, 525-537 (2012).
- Li, S., Weidenfeld, J., Morrisey, E. E. Transcriptional and DNA binding activity of the Foxp1/2/4 family is modulated by heterotypic and homotypic protein interactions. Mol Cell Biol. 24, 809-822 (2004).
- MacDermot, K. D., et al. Identification of FOXP2 truncation as a novel cause of developmental speech and language deficits. Am J Hum Genet. 76, 1074-1080 (2005).
- Vernes, S. C., et al. Functional genetic analysis of mutations implicated in a human speech and language disorder. Hum Mol Genet. 15, 3154-3167 (2006).
