一种简单快速的协议用荧光测量中性脂肪在藻细胞
Summary
一个简单的协议采用尼罗红染色法来确定藻细胞中的中性脂质含量进行说明。这个节省时间的技术提供了一种替代传统的重量为基础的脂质定量协议。它被设计用于监测生物过程性能的具体应用。
Abstract
藻类被认为是优秀的候选人，由于其天然脂质存储功能的可再生燃料来源。强有力的监测藻类发酵过程和筛选新的石油资源丰富的菌株需要一个快速，可靠的协议，用于测定细胞内脂质含量。目前的做法主要依靠重力方法来确定油含量，技术开发几十年前是耗时且需要大量的样本量。在本文中，尼罗红，已经被用来确定脂质体在许多类型的有机体的存在下的荧光染料，掺入一种简单，快速和可靠的协议，用于测量Auxenochlorella protothecoides的中性脂质含量，绿色藻类。该方法使用乙醇，相对温和的溶剂，通透染色前的细胞膜和一个96孔微板中的荧光强度测量，以增加样品的容量。它已经设计编带的监测生物过程性能的具体应用。预先干燥的样品或活的样品从生长培养可在测定中使用。
Introduction
由于其存储在一定应力条件下脂质体的能力，藻类已经收到了极大的关注，近年来作为一种潜在的可再生燃料来源1,2。中性脂肪可以在适当的生长条件3占细胞干重的60％以上。然而，金融业并没有一个简单，干净，快速，可靠的标准化协议，以定量藻细胞的脂含量，以适当监测生物过程的性能，分析文化和屏幕的新品种。
该布莱-代尔重量法开发了一些50年前之间保持4,5今天最常用的技术。虽然这个过程很简单，可靠，方便外出携带，它是耗时的，就必须大样本量，并使得有毒溶剂的使用。这是不实际的，用于分析许多样品从发酵跑步或筛选新的石油资源丰富的菌株。其他方法有BEEN发达，但通常需要先进的设备和不规范6。
这已经获得了极大的兴趣另一种是尼罗红染色。尼罗红，发荧光优先在非极性环境中的染料，已被用于确定或量化脂质体在各种生物体，包括线虫7，酵母8，细菌9和藻类10-19。涉及尼罗红初始技术大多是定性或半定量的，色斑与单反应杯光度法或流式细胞术结合起来。此外，一些类藻类如绿藻有厚胞孔的大多是不可渗透的染料，这限制了该技术10的范围内。
在尼罗红染色法的最新改进，据报道，绕过协议10,11的初始缺点。在卡尔的存在下细胞染色IER溶剂如DMSO中10或乙醇10,11线性化油含量和吸收率之间的关系，从而允许可靠的定量测量。溶剂可帮助通透细胞膜，使尼罗红分子能够通过。此外，结合分光光度计与微孔板读数功能使适合于定量分析的高通量协议。
在这篇文章中我们详细介绍通过染色文化与尼罗红在乙醇，温和溶剂存在测量藻细胞的含油量的简单方法。为了最准确地解释在测量背景噪声，标准曲线相关联的荧光强度，含油量是使用已知的石油成分的藻细胞开发。该方法是改编自先前公布的协议10,11。通过使用96孔分光光度计，1是能够分析在一小时THA样品相同量的T公司将需要数天由重量法来监测。此外，通过使用所需的藻类物种的代表性样品校准该方法中产生相对精确的测量可直接解释的。存在着许多协议概述藻类染色用尼罗红为不同的菌株和应用进行了优化的方法;这里介绍的协议最初是由德拉奥斯西格勒等 11 Auxenochlorella protothecoides，小球藻 ， 栅藻二形 ，和斜生栅藻 ，虽然它很可能适用于许多种类和类。它的设计与监测生物过程性能的具体应用，它同样适用于预先干燥试样和湿样品从不断增长的文化。
Protocol
Representative Results
Discussion
在标准曲线所用的藻类必须是那些被测量相同的实验条件下培养相同的物种。显著改变培养基组成，栽培技术，和染色的协议会影响读数的荧光的强度。己烷萃取（在第1和2中所述）被用于确定在标准曲线用样品的中性脂质含量。为准确的荧光强度测量结果，所有的样品必须在相同的生物量浓度（5 g / L的是在本研究中所用）进行分析。含油量然后可以通过比较，通过标准曲线来容易地确定。对于?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
笔者想感谢加拿大自然科学和工程研究理事会提供该项目的资金支持。
Materials
| Dry Weight | |||
| 25 ml disposable pipettes | Fisher | 13-676-10K | |
| Pipette Bulb | Fisher | 13-681-51 | |
| 40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes | Fisher | 05-562-16A | Teflon needed for hexane |
| Weigh Dishes (polypropylene) | Fisher | 2-202B | |
| 1.5 ml micro-centrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| Centrifuge | Sorvall | RC6plus | |
| Drying Oven (Fisher 625D) | Fisher | 13-254-2 | |
| Storage vials | Fisher | 0337-4 | |
| Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D) | Fisher | 05-40-100 | |
| Gravimetric Quantification | |||
| Porcelain Mortar (Coorstek) | Fisher | 12-961A | |
| Porcelain Pestle (Coorstek) | Fisher | 12-961-5A | |
| 40 ml Centrifugation tubes (FEP) | Fisher | 05-562-16A | Could also use glass tubes |
| Pasteur Glass Pipettes | Fisher | 13-678-20C | |
| Aluminum weigh dishes | Fisher | 08-732-101 | |
| Hexanes | Fisher | H292-4 | |
| Fluorometric quantification of oil content | |||
| Fluorescence multi-well plate reader | Thermo Lab Systems | Fluoroskan Ascent | |
| Fluorescence reader software | Thermo Lab Systems | Ascent Software 2.6 | |
| COSTAR 96 well plate with round bottom | Fisher | 06-443-2 | |
| Nile Red | Sigma | N3013-100MG | |
| Ethanol (Alcohol reagent grade) | Fisher | AC65109-0020 | |
| Imaging Fluorescent cells | |||
| Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope | Leica | DMRXA2 | |
| Microscope slides | Fisher | 12-550-15 | |
| Microscope cover slips | Fisher | 12-541B | |
| Camera | Qimaging | Retiga Ex | |
| Imaging software | Qimaging | QCapture v.1.1.8 |
Referências
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