En enkel og rask protokoll for måling av nøytrale lipider i algecellene med fluoresens

Summary

En enkel protokoll for å bestemme den nøytrale fettinnhold av algecellene ved hjelp av en Nile Red fargingsfremgangsmåten beskrives. Denne tidsbesparende teknikken tilbyr et alternativ til tradisjonelle gravimetriske basert lipid kvantifisering protokoller. Det har blitt designet for den spesifikke anvendelsen av overvåking bioprosessteknologi ytelse.

Abstract

Alger anses gode kandidater for fornybare drivstoff kilder på grunn av deres naturlige fettlagringsmuligheter. Robust kontroll av alge fermenteringsprosesser og screening for nye oljerike stammer krever en rask og pålitelig protokoll for bestemmelse av intracellulær lipidinnhold. Dagens praksis hovedsak basere seg på gravimetriske metoder for å bestemme oljeinnhold, teknikker utviklet tiår siden som er tidkrevende og krever store prøvevolumer. I denne artikkelen er Nile Red, et fluorescerende fargestoff som er blitt brukt for å identifisere tilstedeværelse av lipid-legemer i en rekke typer av organismer, inkorporert i en enkel, rask og pålitelig protokoll for å måle den nøytrale fettinnhold av Auxenochlorella protothecoides, en grønn alge. Fremgangsmåten anvender etanol, en relativt mild oppløsningsmiddel, for å permeabilize cellemembranen før fargingen og en 96 brønn mikro-plate for å øke prøvekapasiteten under fluorescens intensitet målinger. Det har vært utforminged med den spesifikke anvendelsen av overvåking bioprosessteknologi ytelse. Tidligere tørkede prøver eller levende prøver fra en voksende kultur kan anvendes ved assay-bestemmelsen.

Introduction

På grunn av deres evne til å lagre lipidlegemer under visse stress forhold, har alger fått mye oppmerksomhet de siste årene som en potensiell fornybar drivstoffkilde ^1,2. Nøytrale lipider kan utgjøre over 60% av celletørrvekt under egnede vekstbetingelser ^tre. Men næringen ikke har en enkel, ren, rask og pålitelig standardisert protokoll til å kvantifisere fettinnhold av algeceller for å riktig overvåke bioprosessteknologi ytelse, analysere kulturer, og skjermen for nye stammer.

Den Bligh-Dyer gravimetrisk metode utviklet noen 50 år siden er fortsatt blant de mest vanlige teknikker som brukes i dag ^4,5. Mens denne prosedyren er enkel, pålitelig og enkel å utføre, er det tidkrevende, krever store prøvevolumer, og gjør bruk av giftige løsemidler. Det er ikke praktisk for å analysere mange prøver fra en gjæring kjøre eller screening for nye oljerike stammer. Andre metoder har been utviklet, men vanligvis krever avansert utstyr og har ikke blitt standardisert ^seks.

Et alternativ som har fått en stor interesse er Nilen rød flekk. Nile Red, et fargestoff som fluorescerer fortrinnsvis i ikke-polare omgivelser, har vært brukt til å identifisere eller kvantifisere lipid organer i forskjellige organismer inkludert nematoder ^7, gjær ^8, bakterier og alger ^{9, 10-19.} Innledende teknikker som involverer Nile Red var for det meste kvalitative eller semi-kvantitativ, kombinerer flekken med single-kyvette spectrophotometry eller flowcytometri. I tillegg er noen klasser av alger slik som grønnalger har tykke cellebrønner som er stort sett ugjennomtrengelig for fargestoffet, som er begrenset til området av teknikken ^10..

Nylige forbedringer i Nilen Røde flekker metoden har blitt rapportert at omgå de første svakhetene i protokollen ^10,11. Farging av cellene i nærvær av en Carrier oppløsningsmiddel så som DMSO ¹⁰ eller etanol ^10,11 linearizes forholdet mellom olje-innhold og absorbans, slik at for pålitelige kvantitative målinger. Løsningsmidlet bidrar permeabilize cellemembranen slik at Nile Red-molekyler kan passere gjennom. I tillegg, som omfatter et spektrofotometer med mikro-platelese egenskapene gjør det mulig for store gjennomgangs protokoller som er egnet for kvantitativ analyse.

I denne artikkelen detalj en enkel metode for måling av oljeinnholdet i algecellene ved farging kulturer med Nile Red i nærvær av etanol, et mildt oppløsningsmiddel. For å mest nøyaktig utgjør bakgrunnsstøy i målingene, er en standardkurve korrelere fluorescens-intensitet til oljeinnholdet utviklet ved hjelp av algecellene av kjente olje-komposisjon. Metoden er tilpasset fra tidligere publiserte protokoller ^10,11. Ved å bruke en 96-brønns spektrofotometer, er man i stand til å analysere den samme mengden av prøvene i en time that ville ta dager å overvåke ved gravimetriske metoder. Videre, ved kalibrering ved hjelp av representative prøver av den ønskede algearter denne metoden gir forholdsvis nøyaktige målinger som er direkte tolkes. Det finnes mange protokoller som beskriver metoder for farging alger med Nile Red optimalisert for forskjellige stammer og programmer; protokollen som presenteres her ble opprinnelig utviklet av de la Hoz Siegler et al. ¹¹ for Auxenochlorella protothecoides, Chlorella vulgaris, Scenedesmus dimorphus, og Scenedesmus obliquus, selv om det er sannsynlig egnet for mange flere arter og klasser. Det har blitt designet med den spesifikke anvendelsen av overvåking bioprosessteknologi ytelse, og det fungerer like godt for tidligere tørkede prøver og våte prøver fra en voksende kultur.

Protocol

En. Isolering av Dry Alge Biomasse som skal brukes som standarder for Fluorescens Readings Ta en prøve-volum fra den økende algekultur som vil gi i det minste 200 mg tørr biomasse, er 400 til 600 mg foretrekkes. Sentrifuger prøven ved 4 ° C i 10 min ved 10 000 x g. Kast supernatanten og vask pelleten med et like stort volum fosfatbuffer formulert til samme pH som vekstmediet. Gjenta trinn 1,2 i totalt tre vasketrinn. Re-suspendere pellet i de-ionisert vann og overføre til e…

Representative Results

Representative alge-celler farget med Nile Red dye er avbildet i figur 1. Del A og B i figur 1 viser bilder av A. protothecoides dyrket i skytende nitrogen, noe som fører til meget lave intracellulære lipidakkumulering. I deler C og D, prøver av A. protothecoides dyrket under nitrogen begrensning er vist. Under overføring belysning, kan lipid legemer av cellen bli visualisert med nøye kontroll av …

Discussion

De alger som brukes i standardkurven må være de samme arter dyrket under de samme eksperimentelle betingelser som de som blir målt. Vesentlige endringer i mediesammensetning, dyrking teknikk, og fargings protokollen kan påvirke intensiteten av fluorescens-leser. Heksan ekstraksjon (beskrevet i avsnitt 1 og 2) ble anvendt for å bestemme den nøytrale lipid-innhold av prøver som benyttes i standardkurven. For nøyaktig fluorescens intensitet målinger må alle prøvene analyseres på samme biomassekonsentrasjon (5 g…

Materials

Dry Weight
25 ml disposable pipettes	Fisher	13-676-10K
Pipette Bulb	Fisher	13-681-51
40 ml Nalgene Teflon Centrifuge Tubes	Fisher	05-562-16A	Teflon needed for hexane
Weigh Dishes (polypropylene)	Fisher	2-202B
1.5 ml micro-centrifuge tubes	Fisher	05-408-129
Centrifuge	Sorvall	RC6plus
Drying Oven (Fisher 625D)	Fisher	13-254-2
Storage vials	Fisher	0337-4
Bench-top microcentrifuge (Eppendorf 5415D)	Fisher	05-40-100
Gravimetric Quantification
Porcelain Mortar (Coorstek)	Fisher	12-961A
Porcelain Pestle (Coorstek)	Fisher	12-961-5A
40 ml Centrifugation tubes (FEP)	Fisher	05-562-16A	Could also use glass tubes
Pasteur Glass Pipettes	Fisher	13-678-20C
Aluminum weigh dishes	Fisher	08-732-101
Hexanes	Fisher	H292-4
Fluorometric quantification of oil content
Fluorescence multi-well plate reader	Thermo Lab Systems	Fluoroskan Ascent
Fluorescence reader software	Thermo Lab Systems	Ascent Software 2.6
COSTAR 96 well plate with round bottom	Fisher	06-443-2
Nile Red	Sigma	N3013-100MG
Ethanol (Alcohol reagent grade)	Fisher	AC65109-0020
Imaging Fluorescent cells
Leica DMRXA2 (or equivalent) microscope	Leica	DMRXA2
Microscope slides	Fisher	12-550-15
Microscope cover slips	Fisher	12-541B
Camera	Qimaging	Retiga Ex
Imaging software	Qimaging	QCapture v.1.1.8