Fastsettelse av Spontan Locomotor aktivitet i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Drosophila melanogaster er nyttige i å studere genetiske eller miljømessige manipulasjoner som påvirker atferd som for eksempel spontan bevegelsesaktivitet. Her beskriver vi en protokoll som benytter skjermer med infrarøde stråler og dataanalyse programvare for å kvantifisere spontan bevegelsesaktivitet.
Abstract
Drosophila melanogaster har blitt brukt som et utmerket modellorganisme for å studere miljømessige og genetiske manipulasjoner som påvirker virkemåten. En slik oppførsel er spontan bevegelsesaktivitet. Her beskriver vi vår protokoll som benytter Drosophila befolknings skjermer og et sporingssystem som tillater kontinuerlig overvåking av den spontane bevegelsesaktiviteten av fluer i flere dager om gangen. Denne metoden er enkel, pålitelig og objektiv og kan brukes til å undersøke effektene av aldring, kjønn, endringer i kaloriinnholdet i maten, tilsetning av medikamenter, eller genetiske manipulasjoner som etterligner menneskelige sykdommer.
Introduction
Fruktfluer, Drosophila melanogaster, har blitt brukt som en verdifull modellorganisme for å studere mekanismene bak komplekse atferd, for eksempel læring og hukommelse, sosial interaksjon, aggresjon, rusmisbruk, søvn, sensorisk funksjon, frieri, og parring 1,2. En atferd som er blitt studert gjennom flere protokoller er spontan bevegelsesaktivitet. Negativ geotaxis var en av de første metodene som er utviklet for å måle Drosophila-aktivitet, og denne protokoll innebærer måling av prosentandelen av fluer som når en viss høyde av ampullen etter at fluene ble rystet til bunnen av beholderen 1,3. Denne metode har fordelen av å være enkel, billig, og da den ikke krever noe spesielt utstyr den kan utføres i ethvert laboratorium. Det har vært brukt som et verdifullt verktøy for screening for å studere effekten av forskjellige genetiske manipulasjoner på fly mobilitet 3. Det er imidlertid tids-og arbeidskrevende etnd har mulighet for systematiske feil som følge av variabel risting av ampullene og humane opptak.
Den negative geotaxis Metoden ble forbedres ved utvikling av Rapid Iterativ Negative Geotaxis (RING) metoden 4,5, som tar bilder av flue ampuller følgende risting av fluene til bunns. Fordelen med denne protokollen er dens følsomhet og muligheten for å teste et stort antall fly-ampuller på samme tid. Imidlertid har denne protokollen fortsatt potensialet for menneskelig feil, og bare måler negative geotaxis. Andre laboratorier har brukt enkel observasjon i kultur ampuller å bestemme bevegelsesaktiviteten seks.
Nylig flere videoopptak systemer for måling fly bevegelsesaktiviteten har blitt utviklet. En video overvåking protokollen gir tid for justering før opptaket 7. Fremgangsmåten beskrevet av Slawson et al. Bruker også en luftpuls til å stoppe movement før opptaksstart, noe som potensielt kan være en stressfaktor for dyrene 7. Denne metoden gir informasjon om gjennomsnittshastighet, maksimal hastighet, tid tilbringer i bevegelse, etc. En annen tre-dimensjonal sporing system måler den maksimale hastigheten i de enkelte fluene i løpet av ~ 0,2 sekunders fri flukt letting 8.. En tredimensjonal videoovervåkning protokollen bruker fluer som uttrykker GFP og flere kameraer som er utstyrt med filtre som muliggjør påvisning av fluorescens for å bestemme fly mobilitet 9.. Fluer i denne protokollen har en tendens til å stille ut sylindriske flytur mønstre, som er potensielt grunn av formen på Drosophila kultur hetteglass 10. Denne metoden ble forbedret ved bruk av en kuppel som tillater måling av spontan bevegelse av to fluer 11. En high-throughput metode som bruker et kamera for å automatisk overvåke og kvantifisere den enkelte og sosiale atferden til Drosophila har vært også beskrevet 12. Zou etal. utviklet et atferds monitor system (BMS) som bruker to IT-baserte kameraer for å registrere levetid atferd og bevegelser som hvile, flytting, flyr, spise, drikke, eller dødsfall av enkelte tephritid fruktfluer 13. Flere andre videosystemer er utviklet for å overvåke fly atferds aktivitet 14,15.
Her beskriver vi en metode for å kvantifisere Drosophila aktivitet som benytter skjermer befolknings. Disse skjermene er plassert i temperatur-og fuktighetskontrollerte inkubatorer ved 25 ° C på en 12 timers dag-natt lys syklus. Hver befolkningen skjermen har infrarøde stråler plassert i ringer plassert på tre forskjellige høyder. Hver gang et fly beveger seg på tvers av ringene den avbryter den infrarøde strålen, som er registrert av en mikroprosessor som uavhengig registrerer og teller aktiviteten av fluene i løpet av ampullen. En mikroprosessor laster opp den totale aktiviteten innenfor hetteglasset til datamaskinen ved brukerdefinert intervaEr det kunne variere fra 1 sekund til 60 minutter. Metoden er beskrevet her gir rikelig tid for fluer å tilpasse seg det nye miljøet, og gir mulighet for samtidig måling av den spontane bevegelsesaktiviteten av så mange som 120 bestander av fluer. I tillegg beskriver vi tilberedning av maten, fly vedlikehold, sette opp mobilitet befolknings skjermer i temperaturkontrollerte inkubatorer og potensielle faktorer som kan påvirke resultatene. Denne metoden kan brukes til å studere hvordan forskjellige miljømessige eller genetiske modifikasjoner påvirker spontan lokomotorisk aktivitet av fluene.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spontan bevegelsesaktiviteten av fluer er påvirket av mange faktorer som for eksempel alder, genetisk bakgrunn og kjønn 2,13,18,19. I tillegg kan miljømessige faktorer slik som kaloriinnholdet i maten, temperaturen i omgivelsene, tilsetning av forskjellige stoffer, og dag / natt-lys syklus påvirke fly-aktivitet. For eksempel hannfluer av samme alder har en høyere spontan fysisk aktivitet sammenlignet med kvinner (figur 1). Derfor bør fluer av samme alder og kjønn bli sammenlignet med h…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et stipend fra National Institutes of Health (AG023088 til BR).
Materials
| Sucrose FCC Food Grade 100 LB, | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90471380 | |
| Brewer’s Yeast | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90331280 | |
| Drosophila Agar Fine | SciMart | DR-820-25F | |
| Cornmeal | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90141125 | |
| Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept | Sigma | H5501-5KG | |
| EtOH | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Active Dry Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Fly CO2 pad | LabScientific | BGSU-7 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | |
| Drosophila carbon dioxide (CO2) tank | Airgas | UN1013 | |
| Small paint brush for pushing the flies | |||
| Shell vial wide | Fischer Scientific | AS519 | |
| Buzzplugs for wide plastic vials | Fischer Scientific | AS275 | |
| Glass vials (25x95mm) | Fischer Scientific Kimble 60931-8 | AS-574 | |
| Sponge plugs for glass vials | SciMart | DR-750 | |
| Drosophila Food Dispenser | Applied Scientific (Fischer Scientific) | AS780Q | |
| DPM Drosophila Population Monitor | Trikinetics Inc. | ||
| DC Power Supply with line cord | Trikinetics Inc. | ||
| PSIU9 The Power Supply Interface Unit | Trikinetics Inc. | ||
| Telephone cables and 5 way splitters | Trikinetics Inc. | ||
| Universal Serial Bus (USB) hardware | Trikinetics Inc. | ||
| Macintosh or Windows PC with UCB port | |||
| DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Macintosh | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| USB software (PSIUdrivers.zip) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem Notes 308 | (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf |
Referências
- Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
- Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p., Cook-Wiends, E. Functional senescence in Drosophila melanogaster. Aging Res. Rev. 4 (3), 372-397 (2005).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
- Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
- Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
- Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
- Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
- Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
- Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
- Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
- Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
- Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
- Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. . Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, (2010).
- Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).
