Bestämning av spontan rörelseaktivitet i<em> Drosophila melanogaster</em
Summary
Drosophila melanogaster är användbara för att studera genetiska eller miljömässiga manipulationer som påverkar beteenden såsom spontan rörelseaktivitet. Här beskriver vi ett protokoll som använder skärmar med infraröda strålar och dataanalys programvara för att kvantifiera spontan rörelseaktivitet.
Abstract
Drosophila melanogaster har använts som ett utmärkt modellorganism för att studera miljömässiga och genetiska manipulationer som påverkar beteendet. Ett sådant beteende är spontan rörelseaktivitet. Här beskriver vi våra protokoll som använder Drosophila befolknings monitorer och ett tracking-system som möjliggör kontinuerlig övervakning av den spontana rörelseaktivitet av flugor i flera dagar åt gången. Denna metod är enkel, pålitlig och objektiv och kan användas för att undersöka effekterna av åldrande, sex, förändringar i kalorihalten i livsmedel, tillsats av droger eller genetiska manipulationer som efterliknar mänskliga sjukdomar.
Introduction
Fruktflugor, Drosophila melanogaster, har använts som en värdefull modellorganism för att studera mekanismerna bakom komplexa beteenden såsom inlärning och minne, social interaktion, aggression, drogmissbruk, sömn, sensorik, uppvaktning och parning 1,2. Ett beteende som har studerats genom flera protokoll är spontan rörelseaktivitet. Negativ geotaxis var en av de första metoder som utvecklats för att mäta Drosophila aktivitet, och detta protokoll innebär att mäta andelen flugor som når en viss höjd på flaskan efter flugor skakades till botten av behållaren 1,3. Denna metod har fördelen av att vara enkel, billig, och eftersom det inte kräver någon särskild utrustning den kan utföras på alla laboratorier. Den har använts som ett värdefullt verktyg för screening för att studera effekterna av olika genetiska manipulationer på fluga rörlighet 3. Men det är tids-och arbetskrävande ennd har möjlighet att fördomar på grund av varierande skakning av flaskorna och mänskliga inspelningar.
Den negativa geotaxis metoden förbättras genom utveckling av de negativa geotaxis (RING)-metoden Rapid Iterativ 4,5, som tar bilder av flugan ampuller följande skakning av flugorna till botten. Fördelen med detta protokoll är dess känslighet och möjligheten att testa ett stort antal gylf ampuller samtidigt. Dock har detta protokoll fortfarande risken för mänskliga fel, och bara mäter negativa geotaxis. Andra laboratorier har använt enkel observation i odlingsflaskor för att bestämma rörelseaktivitet 6.
Nyligen flera videoinspelning system för mätning fluga rörelseaktivitet har utvecklats. En videoövervakning protokollet ger tid för anpassning före inspelning 7. Den metod som beskrivs av Slawson et al. Använder också en luftpuls för att stoppa movement fram till början av inspelningen, vilket eventuellt kan vara en stressfaktor för djuren 7. Metoden ger information om medelhastighet, maxhastighet, tid spenderar i rörelse, etc. En annan tredimensionell tracking system mäter den maximala hastigheten för enskilda flugor under ~ 0,2 sekunder av fri flygning start 8. En tredimensionell videoövervakning protokollet använder flugor som uttrycker GFP och flera kameror försedda med filter som möjliggör detektion av fluorescens för att bestämma farten rörlighet 9. Flugor i detta protokoll tenderar att uppvisa cylindriska flygmönster, som är potentiellt på grund av formen av Drosophila kultur Injektionsflaskor 10. Denna metod förbättrades genom att använda en kupol som möjliggör mätning av spontan rörelse av två flugor 11. En hög genomströmning metod som använder en kamera för att automatiskt övervaka och mäta det individuella och sociala beteende Drosophila har också beskrivits 12. Zou etal. utvecklat ett beteendemonitorsystem (BMS) som använder två datorstödda kameror för att registrera livstid beteende och rörelser som vila, rörelse, flyga, äta, dricka, eller dödsfall av enskilda tephritid fruktflugor 13. Flera andra videosystem har utvecklats för att övervaka flyga beteende aktivitet 14,15.
Här beskriver vi en metod för att kvantifiera Drosophila aktivitet som utnyttjar befolknings monitorer. Dessa skärmar är inrymda i temperatur-och fuktighetsreglerade inkubatorer vid 25 ° C på en 12 timmars dag-nattlampa cykel. Varje population monitor har infraröda strålar som placerats i ringar placerade på tre olika höjder. Varje gång en fluga rör sig över ringarna det avbryter den infraröda strålen, som registreras av en mikroprocessor som självständigt register och räknar aktiviteten av flugor inne i flaskan. En mikroprocessor laddar upp den totala aktiviteten i flaskan till datorn vid användardefinierade intervaÄr det kan variera från 1 sekund till 60 minuter. Den metod som beskrivs här ger gott om tid för flugorna att anpassa sig till den nya miljön och möjliggör samtidig mätning av den spontana rörelseaktiviteten av så många som 120 populationer av flugor. Dessutom beskriver vi förbereda maten, flyga underhåll, inrätta mobilitetsbefolknings monitorer i temperaturkontrollerade inkubatorer och potentiella faktorer som kan påverka resultaten. Denna metod kan användas för att studera hur olika miljö-eller genetiska modifieringar påverkar spontan rörelseaktivitet av flugorna.
Protocol
Representative Results
Discussion
Spontan rörelseaktivitet av flugor påverkas av många faktorer som ålder, genetisk bakgrund och kön 2,13,18,19. Dessutom kan miljöfaktorer såsom kaloriinnehållet i maten, omgivningens temperatur, tillägg av olika droger, och dag / nattlampa cykel påverkar fluga aktivitet. Till exempel, manliga flugor i samma ålder har en högre spontan fysisk aktivitet jämfört med kvinnor (Figur 1). Därför bör flugor i samma ålder och kön kan jämföras med varandra. När man undersöker effe…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av ett bidrag från National Institutes of Health (AG023088 till BR).
Materials
| Sucrose FCC Food Grade 100 LB, | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90471380 | |
| Brewer’s Yeast | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90331280 | |
| Drosophila Agar Fine | SciMart | DR-820-25F | |
| Cornmeal | Fisher Scientific MP Biomedicals | ICN90141125 | |
| Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept | Sigma | H5501-5KG | |
| EtOH | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Active Dry Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Fly CO2 pad | LabScientific | BGSU-7 | |
| Stereo Microscope | Olympus | SZ40 | |
| Drosophila carbon dioxide (CO2) tank | Airgas | UN1013 | |
| Small paint brush for pushing the flies | |||
| Shell vial wide | Fischer Scientific | AS519 | |
| Buzzplugs for wide plastic vials | Fischer Scientific | AS275 | |
| Glass vials (25x95mm) | Fischer Scientific Kimble 60931-8 | AS-574 | |
| Sponge plugs for glass vials | SciMart | DR-750 | |
| Drosophila Food Dispenser | Applied Scientific (Fischer Scientific) | AS780Q | |
| DPM Drosophila Population Monitor | Trikinetics Inc. | ||
| DC Power Supply with line cord | Trikinetics Inc. | ||
| PSIU9 The Power Supply Interface Unit | Trikinetics Inc. | ||
| Telephone cables and 5 way splitters | Trikinetics Inc. | ||
| Universal Serial Bus (USB) hardware | Trikinetics Inc. | ||
| Macintosh or Windows PC with UCB port | |||
| DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Macintosh | www.trikinetics.com | ||
| DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) | www.trikinetics.com | ||
| USB software (PSIUdrivers.zip) | www.trikinetics.com | ||
| DAMSystem Notes 308 | (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf |
Referências
- Ali, Y. O., Escala, W. E., Ruan, K., Zhai, R. G. Assaying Locomotor, Learning, and Memory Deficits in Drosophila Models of Neurodegeneration. J. Vis. Exp. 49, 2504 (2011).
- Jones, M. A., Grotewiel, M. Drosophila as a model for age-related impairment in locomotor and behaviors. Exp. Gerontol. 46 (5), 320-325 (2011).
- Grotewiel, M. S., Martin, I., Bhandari, p., Cook-Wiends, E. Functional senescence in Drosophila melanogaster. Aging Res. Rev. 4 (3), 372-397 (2005).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid Iterative Negative Geotaxis (RING): a New Method for Assessing Age-related Locomotor Decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40 (5), 386-395 (2005).
- Nichols, C. D., Bechnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. J. Vis. Exp. 61, 3791 (2012).
- Long, T. A., Rice, W. R. Adult locomotor activity mediates Intralocus sexual conflict in a laboratory-adapted population of Drosophila melanogaster. Proc. Biol. Sci. 274 (1629), 3105-3112 (2007).
- Slawson, J. B., Kim, E. Z., Griffith, L. C. High-resolution video tracking of locomotor in adult Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. 24 (24), 1096 (2009).
- Marden, J. H., Rogina, B., Montooth, K. L., Helfand, S. L. Conditional tradeoff between aging and organismal performance of Indy long-lived mutant flies. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 100 (6), 3369-3372 (2003).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, L. Simultaneous tracking of fly movement and gene expression using GFP. BMC Biotechnol. 8, 93 (2008).
- Grover, D., Yang, J., Tavaré, S., Tower, J. Simultaneous tracking of movement and gene expression in multiple Drosophila melanogaster flies using GFP and DsRED fluorescent reporter transgenes. BMC Res Notes. 2 (58), 1-11 (2009).
- Ardekani, R., et al. Three-dimensional tracking and behaviour monitoring of multiple fruit flies. J. R. Soc. Interface. 10 (78), (2013).
- Branson, K. A., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nat Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
- Zou, S., et al. Recording Lifetime Behavior and Movement in an Invertebrate Model. PLOS One. 6 (4), (2011).
- Valente, D., Golani, I., Mitra, P. P. Analysis of the trajectory of Drosophila melanogaster in a circular open field arena. PLoS One. 2 (10), 1083 (2007).
- Inan, O. T., Marcu, O., Sanchez, M. E., Bhattacharya, S., Kovacs, K. T. A portable system for monitoring the behavioral activity of Drosophila. J Neurosci. Methods. 202 (1), 45-52 (2011).
- Parashar, V., Rogina, B. dSir2 mediates the increased spontaneous physical activity in flies on calorie restriction. Aging. 1 (6), 529-541 (2009).
- Kaneuchi, T., Togawa, T., Matsuo, T., Fuyama, Y., Aigaki, T. Efficient measurement of H2O2 resistance in Drosophila using an activity monitor. Biogerontology. 4 (3), 157-165 (2003).
- Carey, J. R., et al. Age-specific and lifetime behavior patterns in Drosophila melanogaster and the Mediterranean fruit fly, Ceratitis capitata. Exp. Gerontol. 41 (1), 93-97 (2006).
- Rhodenizer, D., Martin, I., Bhandari, P., Pletcher, S. D., Grotewiel, M. Genetic and environmental factors impact age-related impairment of negative geotaxis in Drosophila by altering age-dependent climbing speed. Exp. Gerontol. 43 (8), 739-749 (2008).
- Osterwalder, T., Yoon, K. S., White, B. H., Keshishian, H. A conditional tissue-specific transgene expression system using inducible GAL4. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (22), 12596-12601 (2001).
- Dietzl, G., et al. A genome-wide transgenic RNAi library for conditional gene inactivation in Drosophila. Nature. 448 (7150), 151-156 (2007).
- Chiu, J. C., Low, K. H., Pike, D. H., Yildirim, E., Edery, I. Assaying locomotor activity to study circadian rhythms and sleep parameters in Drosophila. J. Vis. Exp. 43, 2157 (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protoc. 11, (2010).
- Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. . Processing circadian data collected from the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Protoc. 11, (2010).
- Ardekani, R., Tavaré, S., Tower, J. Assessing senescence in Drosophila using video tracking. Methods Mol. Biol. 965, 501-516 (2013).
