Apresentamos neste artigo uma novela que se estende plataforma que pode ser usada para investigar as respostas das células individuais a complexa deformação mecânica biaxial anisotrópica e quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos.
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Artigo de método
Uma plataforma Novel Alongamento para Aplicações em Celular e Tecidual mechanobiology
Neste artigo
Resumo
Resumo
As ferramentas que permitem a aplicação de forças mecânicas de células e tecidos, ou que podem quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos têm contribuído significativamente para o entendimento de mechanobiology básico. Estas técnicas têm sido amplamente utilizados para demonstrar como o aparecimento e progressão de várias doenças são fortemente influenciados por estímulos mecânicos. Este artigo apresenta uma plataforma multi-funcional biaxial alongamento (BAXS) que pode estimular mecanicamente células individuais ou quantificar a rigidez mecânica dos tecidos. A plataforma BAXS consiste de quatro motores de bobina de voz, que pode ser controlada de forma independente. As células individuais podem ser cultivadas num substrato flexível que pode ser ligada aos motores que permitem uma para expor as células a campos de deformação complexos, dinâmicos, e variando espacialmente. Por outro lado, através da incorporação de uma célula de carga de força, pode-se também quantificar as propriedades mecânicas dos tecidos primários, eles são expostos a ciclos de deformação.Em ambos os casos, um conjunto apropriado de braçadeiras devem ser concebidas e montadas para os motores de plataforma BAXS de modo a segurar firmemente o substrato flexível ou o tecido de interesse. A plataforma BAXS pode ser montado em um microscópio invertido para realizar luz transmitida em simultâneo e / ou imagem de fluorescência para verificar a resposta estrutural ou bioquímica da amostra durante as experiências de alongamento. Este artigo fornece detalhes experimentais do projeto e utilização da plataforma BAXS e apresenta os resultados de estudos de tecidos inteiros única célula e. A plataforma BAXS foi usado para medir a deformação de núcleos nas células do rato mioblastos individuais em resposta ao substrato tensão e para medir a rigidez de isolados de rato aortas. A plataforma BAXS é uma ferramenta versátil, que pode ser combinado com vários microscopia óptica, a fim de proporcionar novos conhecimentos mechanobiological nos níveis de tecidos sub-celular, celular e inteiro.
Introdução
O microambiente mecânica desempenha um importante papel em muitas funções celulares tais como a proliferação, migração e diferenciação, que têm um impacto profundo no desenvolvimento e homeostasia dos tecidos e também em doenças 1-6. Ao longo dos anos, uma série de ferramentas experimentais têm sido utilizados para estimular mecanicamente as células ou tecidos e medir as propriedades mecânicas dos tecidos biológicos com o objetivo de aumentar a compreensão das mechanobiology básico e estudando o início e progressão de doenças 6-17. No entanto, deve-se muitas vezes dependem de vários dispositivos experimentais diferentes, a fim de alcançar os obj....
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Protocolo
1. Deformação mecânica de células individuais
- Fabricação de um substrato de PDMS com partículas fluorescentes incorporadas
Antes do fabrico do substrato, as microesferas fluorescentes em solução aquosa, são suspensas de novo em isopropanol para melhorar a mistura do grânulo em PDMS, devido à sua natureza hidrofóbica.- Pipetar 500 l de microesferas fluorescentes para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL e centrifuga-se a 16.200 xg durante 10 min.
- Descartar o sobrenadante e adicionar 500 mL de isopropanol seguido de 5 min de agitação em vórtice. Coloque o frasco de lado durante a noite, no escuro, a fim de permitir que as partículas ....
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Resultados
Alongamento celular
A plataforma BAXS foi utilizado para investigar a resposta mecânica do núcleo do rato em células individuais de mioblastos (C2C12) exposto a uma deformação do substrato de 25%. Células de mioblastos são encontrados no tecido muscular e estão constantemente expostos a estiramento mecânico e compressão in vivo. As propriedades de forma e mecânicas do núcleo celular têm demonstrado desempenhar um papel importante na regulação da expressão de genes e.......
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Discussão
A plataforma BAXS aqui apresentado facilita numerosas experiências no estudo de mechanobiology, a partir de investigações de células individuais de tecidos completos. Além disso, a plataforma é altamente flexível e configurável, permitindo a numerosas experiências de estimulação mecânica e os ensaios de tracção de multi-axial. A plataforma também permite a manutenção de células e tecidos em condições fisiológicas e permite a microscopia simultânea durante as experiências de alongamento. Os dois experimentos descritos na.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
DT foi apoiado por uma bolsa de estudo de pós-doutorado de Le Fonds de Recherche du Québec-Nature et Technologies (FQRNT) e um MITACS Elevate Estratégico Fellowship. CMC foi apoiado por uma bolsa de estudo de pós-doutorado de le Fonds de Recherche en Santé du Québec (FRSQ) e Ernest e Margaret Ford cardiologia dotado bolsa de pesquisa da Universidade de Ottawa Heart Institute. EOB foi apoiado por subvenções de funcionamento MOP80204 do Instituto Canadense de Pesquisa em Saúde (CIHR) e T6335 da Heart and Stroke Foundation of Ontario. O CIHR e Medtronic fornecer coletivamente EOB com uma cadeira da pesquisa peer-reviewed (URC # 57093). AEP é financiado pelas Ciências Na....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Adesivos PDMS | Ellsworth | 184 SIL ELAST KIT 0,5KG | A proporção entre a base e o reticulador usado neste protocolo é de 20:1. Misture em um capuz laminar para evitar que a poeira contamine seu |
| Microesferas fluorescentes FluoSpheres | Invitrogen | F8810 | Mantenha longe da luz. |
| Bobina de voz linear | Moticont | LVCM-051-051-01 | O motro vem em duas peças (ímã e bobina). Ele deve ser montado em um sistema de rolamento de esferas para ser funcional. |
| Corrediça de rolamento de esferas | Edmund Optics | NT37-360 | Corrediças de rolamento de esferas de movimento linear miniatura e pequeno |
| Estágio de posicionamento linear Edmund | Optics | 38-960 | Center Drive 1,25" Estágios de tradução linear quadrada |
| Codificador óptico | Sistemas GSI microE | Mercury II 1600S - Codificador incremental reflexivo de resolução de 0,5um | . |
| Controlador de movimento | Galil | DMC-2143(DIN)-DC48 com AMP-20440 | Controlador de 4 eixos com um amplificador de 4 eixos |
| Célula de carga | Honeywell | 31 de baixa | célula de carga miniatura com uma faixa de 0-150 g |
| Pinos de minúcias de insetos (0,20 mm) | Serviço de pinos Austerlitz Pinos | de aço inoxidável que são dobrados em forma de triângulo aberto | |
| SU-8 2050 | Micro Chem | SU-8 2050 | Fotorresistente negativo epóxi permanente. Mantenha longe do calor e da luz |
| Sistema de tratamento de plasma de ar | de plasma de oxigênio Glowresearch | ||
| Colágeno de cauda de rato | Invitrogen | A10483-01 | Colágeno I, cauda de rato 5 mg/ml |
| Hoechst 33342 | Invitrogen | R37605 | Corante fluorescente específico para DNA. Mantenha na geladeira. |
| Aquecedores flexíveis isolados Kapton (filme de poliimida) | omega.ca | aquecedores flexíveis KHLV-0504 / (10) -P | 28 V; pode ser fornecido com controladores de |
| temperatura e processo de ajuste automático de 24 V 1/16 DIN | omega.ca | de temperatura CN63200-R1-LV | ; alimentação 24 V. |
| Meio de cultura DMEM | Hyclone | SH3024301 | Dulbecco' s Modificado 30 Eagle Médio. Manter em 4 ° C |
| Penicilina-estreptomicina | Hyclone | SV30010 | Mantenha o estoque congelado. Mantenha a solução funcionando em 4 °C. |
| Soro fetal bovino (FBS) | Hyclone | SH3039603C | Manter congelado. |
| Tripsina 0,05% | Hyclone | SH30236,02 | Mantenha congelado. Digestão de proteínas de ligação celular para subcultivo |
| Hepes | Wisent Inc | 330-050-EL | Solução salina tamponada com HEPES |
| NaCl | Fisher Scientific | BP358-1 | Solução salina tamponada com HEPES / Solução fisiológica Krebs |
| Fisher | Scientific | BP366-500 | Solução salina tamponada com HEPES / Solução fisiológica Krebs |
| MgSO4 | Fisher Scientific | M65-500 | Solução salina tamponada com HEPES / Solução fisiológica Krebs |
| CaCl2 | Fisher Scientific | C614-500 | Solução salina tamponada com HEPES / Solução fisiológica de Krebs |
| Dextrose | Fisher Scientific | BP220-1 | Solução salina tamponada com HEPES / Solução fisiológica de Krebs |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | BP328-1 | Solução fisiológica de Krebs |
| KH2PO4 | Fisher Scientific | BP362-500 | Solução fisiológica de Krebs |
| Carbogen 95% O2/5% CO2 | Lindle | DIN:02154749 | Solução fisiológica de Krebs oxigenação |
| Nocodazol | Sigma | M1404 | Agente de despolimerização de microtúbulos |
| Citocalasina-D | Sigma | C8273 | Agente de despolimerização de filamentos de actina |
| Anti-&alfa;- SMA-FITC | Sigma | F3777 | Usado para corar e quantificar o conteúdo de células musculares lisas |
| Picrosirius red stain | Fluka | 43665 | Usado para corar e quantificar o conteúdo de colágeno |
Referências
- Yim, E. K., Sheetz, M. P. Force-dependent cell signaling in stem cell differentiation. Stem Cell Res Ther. 3, (2012).
- Vogel, V., Sheetz, M. Local force and geometry sensing regulate cell functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 7, 265-275 (2006).
- Wang, N.....
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Reimpressões e permissões
