Ribosomer spiller en central rolle i proteinsyntesen. Polyribosome (polysom) fraktionering af saccharosedensitetsgradientcentrifugering giver mulighed for direkte bestemmelse af oversættelse effektiviteten af individuelle mRNAer på en genom-plan. Desuden kan denne metode anvendes til biokemisk analyse af ribosom-og polysom-associerede faktorer såsom chaperoner og signalstoffer.
mRNA oversættelse spiller en central rolle i reguleringen af genekspression og repræsenterer den mest energikrævende proces i pattedyrceller. Følgelig dysregulering af mRNA-translation anses for at spille en vigtig rolle i en række patologiske tilstande, herunder cancer. Ribosomer også vært chaperones, som letter foldning af spirende polypeptider, hvorved modulerende funktion og stabilitet af nyligt syntetiserede polypeptider. Desuden nye data viser, at ribosomer tjene som en platform for et repertoire af signalmolekyler, som er impliceret i en række post-translationelle modifikationer af nyligt syntetiserede polypeptider, som de fremgår af ribosomet, og / eller komponenter translationel maskiner. Heri er en veletableret metode til ribosomet fraktionering hjælp saccharosedensitetsgradientcentrifugering beskrevet. I forbindelse med egenudviklede "anota" algoritme denne metode giver mulighed for direkte bestemmelse af forskelrential oversættelse af individuelle mRNAs på en genom-plan. Desuden kan denne alsidige protokol anvendes til en række biokemiske undersøgelser med henblik at dissekere funktionen af ribosom-associeret protein-komplekser, herunder dem, der spiller en central rolle i foldning og nedbrydning af nyligt syntetiserede polypeptider.
De regulatoriske netværk der styrer genekspression er blevet grundigt undersøgt i de seneste to årtier. Langt størstedelen af disse forskningsindsats med fokus på transkriptionel regulering, hvorved ændringer i steady state mRNA niveauer på en genom-dækkende skala blev anvendt til at bestemme såkaldte "genekspression" profiler. Nylige undersøgelser viser, at steady-state mRNA niveauer kun løst svare til sammensætningen af proteom 1,2, hvilket indikerer, at de posttranskriptionel mekanismer, herunder mRNA oversættelse, spiller en stor rolle i regulering af genekspression 3,4. Faktisk er det blevet anslået, at ~ 50% af protein niveauer fastsættes på niveauet af mRNA oversættelse udødeliggjorte musefibroblaster 5.
mRNA oversættelse er et stærkt reguleret proces, hvor mRNAer omsættes til proteiner via orkestreret handling af ribosomer, transfer RNA (tRNA'er) og tilbehør faktorer commonly kaldet oversættelse faktorer (TFS) 6. Proteinsyntese er den mest energikrævende proces i pattedyrceller 7 og derfor globale mRNA oversættelse satser reguleres til at rumme næringsstof tilgængelighed og celleproliferation satser 8. Ud over ændringer i den globale mRNA oversættelse satser, forskellige ekstracellulære stimuli (fx hormoner og vækstfaktorer), intracellulære signaler (f.eks aminosyre niveauer) og forskellige former for stress (f.eks ER-stress) inducerer selektive ændringer i puljer af mRNA'er, der er at blive oversat (translatome) 6. Afhængigt af typen af stimulus oversættelse aktivitet af nogle, men ikke alle mRNA'er dramatisk påvirket, hvilket resulterer i ændringer i proteomet, der kræves til at montere en hurtig cellulært respons 6. Disse kvalitative og kvantitative ændringer i translatome menes at være medieret af samspillet mellem trans-virkende faktorer (fx </em> komponenter af translationel maskiner, hjælpepersonale faktorer eller miRNA), og cis-elementer (RNA elementer eller funktioner) til stede i udvalgte delmængder af mRNAer 6,9. For eksempel ændringer i niveauerne og / eller aktiviteten af hastighedsbegrænsende translationsinitiation faktorer eIF4E og eIF2 modulere selektivt oversættelse af udskrifter er baseret på de specifikke 5'UTR har 6. eIF4E og eIF2 er nødvendige for ansættelsen af mRNA og initiativtager tRNA til ribosomet, henholdsvis 6. En stigning i eIF4E aktivitet selektivt styrker oversættelse af mRNAs huser lange og meget strukturerede 5'UTRs herunder kodning spredning og overlevelse stimulerende proteiner, herunder cykliner, c-myc og Bcl-xL 10. Til gengæld inaktivering af eIF2 fører til en global proteinsyntese standsning, mens selektivt opregulering af translation af mRNA'er, der indeholder korte inhibitoriske opstrøms åbne læserammer (uORFs) i deres 5'UTRs, såsom dem, der koder for store transcriptional regulatorer af det udfoldede protein respons (fx ATF4). Som reaktion på forskellige stimuli, herunder næringsstoffer, vækstfaktorer og hormoner, det mekanistiske / pattedyr målet på rapamycin (mTOR) pathway stimulerer eIF4E aktivitet ved at inaktivere 4E-bindende protein (4E-BP) familie oversættelse undertrykkere, mens MAPK vejen direkte phosphorylates eIF4E 6,11. Til gengæld eIF2α kinaser (dvs. PERK, PKR, HRI og GCN2) hæmmer eIF2 ved phosphorylering sin eIF2α regulatorisk underenhed som respons på næringsstof afsavn, ER-stress og virus infektion 6,12. Ændringer i aktivitet og / eller udtryk for TFs, har andre dele af translationel maskiner og lovgivningsmæssige faktorer, herunder miRNA blevet observeret i forskellige patologiske tilstande, herunder kræft, metaboliske syndromer, neurologiske og psykiatriske lidelser, og nyre-og hjertekarsygdomme 13-19. Kollektivt indikerer disse data, at translationel migchanisms spiller en central rolle i at opretholde cellehomeostase og at deres ophævelsen spiller en central rolle i ætiologien af forskellige sygdomme hos mennesker.
Heri er en protokol til fraktionering af polysomer ved saccharosedensitetsgradientcentrifugering i pattedyrceller, som bruges til at adskille polysomer fra monosomer, ribosomale subunits og messenger ribonucleoprotein partikler (mRNPs) beskrevet. Dette muliggør forskelsbehandling effektivt oversat (forbundet med tunge polysomer) fra dårligt oversat (associeret med lys polysomer) mRNA'er. I dette assay er ribosomer immobiliseret på mRNA under anvendelse oversættelse forlængelses-inhibitorer, såsom cycloheximid 20 og cytosoliske ekstrakter separeret på 5-50% lineære saccharosedensitetsgradienter ved ultracentrifugering. Efterfølgende fraktionering af saccharosegradienter tillader isolering af mRNA'er i forhold til antallet af ribosomer, de binder til. RNA ekstraheret fra hver fraktion kan derefter anvendes til at bestemmeændringer i fordelingen af mRNA'er over gradienten mellem forskellige betingelser, hvorved effektiviteten øges fra toppen til bunden af gradienten translationelle. Northern blotting eller kvantitativ revers transkription-polymerase-kædereaktion (QRT-PCR) anvendes til at bestemme niveauer af mRNA'er i hver fraktion.
Alternativt fraktioner, der indeholder tunge polysomer (typisk mere end 3 ribosomer) sammenlægges og genom-dækkende polysom-associerede mRNA niveauer bestemmes ved hjælp af microarray eller dyb-sekventering. Det er af yderste vigtighed at understrege, at niveauerne af polysom-associerede mRNAs er, foruden oversættelse påvirket af transskriptionelle og posttranskriptionel mekanismer, der påvirker cytosoliske mRNA'er niveauer 21. Derfor, for at bestemme forskelle i oversættelse ved hjælp af genom-dækkende data fra polysom-associerede mRNA er det nødvendigt at korrigere for effekterne fra trin i genekspression vej, der er opstrøms for oversættelsetion 21. At tillade en sådan korrektion, er cytosole RNA udarbejdes parallelt med polysom-associeret RNA fra hver prøve, og genom-dækkende steady-state mRNA niveauer bestemmes 21. I øjeblikket er de såkaldte "oversættelse-effektivitet" (TE) score (dvs. log-forholdet mellem polysom-associerede mRNA data og cytosol mRNA data) er ofte ansat til at korrigere for effekterne af ændringer i cytosol mRNA niveauer på oversættelse effektiviteten af en givet mRNA 22.. Men ved hjælp af TE scorer til at identificere forskellen oversættelse er forbundet med betydelige antal falsk positive og falsk negative resultater på grund af en matematisk egenskab af TE-scorer almindeligvis omtales som falsk korrelation 27. Faktisk en undersøgelse af datasæt fra flere laboratorier viste, at sådanne falske korrelationer synes at være uundgåelig, når man analyserer ændringer i translatomes 23. Det fik udvikling af "analyse af differentieret tr anslation "(anota) algoritme, som ikke lider af de nævnte mangler 23. Under anota-analyse en regressionsmodel anvendes til at udlede mål for translationel aktivitet uafhængig af cytosole RNA-niveauer. Sådanne foranstaltninger sammenlignes dernæst mellem vilkår og en statistik beregnes. Brugeren har mulighed for at anvende en varians krympning metode, der forbedrer den statistiske effekt og reducerer forekomsten af falske positive fund i undersøgelser med få gentagelser 24. Signifikant, blev det for nylig påvist, at forstyrrelser i translatome fanget af anota, men ikke TE score korrelerer med ændringer i proteomet 25. Derfor er det stærkt anbefales at anvende anota analyse til identifikation af ændringer i oversættelse på en genom-plan. Mens den teoretiske fundament for anota algoritmen blev drøftet indgående tidligere 21,23,26, her er fokus på, hvordan man anvender det i praksis.
ve_content "> Ud over at studere ændringer i mRNA translation aktivitet i cellen, kan det ribosom fraktionering protokol bruges til at isolere og biokemisk og funktionelt karakterisere ribosom-og polysom-associeret protein-komplekser. har denne fremgangsmåde med succes været indsat i fortiden for at identificere komplekser, der regulerer stabiliteten af nyligt syntetiserede polypeptider 27 og / eller er involveret i phosphorylering af komponenter af den translationelle maskineri. Denne anvendelse af polysom fraktioneringsmetode vil også blive kort beskrevet.Denne artikel beskriver en veletableret polysom fraktionering protokol efterfulgt af en in-house udviklede analysemetode til at opfange kvalitative og kvantitative ændringer i translationel aktivitet på en genom-plan i pattedyrceller. For en vellykket gennemførelse af denne protokol, særlig opmærksomhed bør rettes mod 1) cellekonfluens (som spredning priser og tilgængeligheden af næringsstoffer korrelerer med mRNA oversættelse aktivitet og kan påvirke sammensætningen af translatome bør cellekonfluens være konsekvent i hele gentagelser og eksperimentelle forhold), 2) Hurtig cellelysering (Uanset tilstedeværelsen af cycloheximid og RNAse inhibitorer i buffere bør lysis være hurtig og cellulære ekstrakter bør oven på sucrosegradienter umiddelbart efter lysis at forhindre RNA-nedbrydning og dissociation af polysomer), 3) Gradient forberedelse (for at sikre høj data reproducerbarhed bør saccharosegradienter blive udarbejdet ved hjælp af gradient maker og spebør tages sielle forsigtig, når du håndterer dem).
Ud over at studere ændringerne i translationel aktivitet, kan denne protokol anvendes til at isolere ribosom-associeret protein-komplekser og fastlægger deres fysiologiske funktioner. Til dette formål kan niveauer og phosphoryleringsstatus af forskellige ribosom-associerede proteiner bestemmes ved TCA-præcipitation, efterfulgt af Western-blotting, mens ribosom-associerede protein-komplekser kan immunopræcipiteret fra gradientfraktioner og analyseret ved Western blotting eller massespektrometri. En mangel ved denne teknik er, at den langsomme gradientfraktion metode kan resultere i dissociation af selv tæt bundne proteiner, hvis bindende kinetik i hastig forening / dissociation. Faktorer forbundet med nyligt syntetiserede polypeptider er typiske eksempler. Nyligt syntetiserede polypeptider nye danne ribosomerne kan immobiliseres på protein-komplekser, der er forbundet med ribosomer anvendelse af kemiske tværbindingsmidler, såsom 3, 3'-dithiobis [sulfosuccinimidylpropionate] (DTSSP) 31. Denne fremgangsmåde har vist, at receptoren for Aktiveret C Kinase 1 (Racks1) / c-Jun N-terminal kinase (JNK) / eukaryot translation elongeringsfaktor 1A2 (eEF1A2) komplekset regulerer nedbrydning af nyligt syntetiserede polypeptider som reaktion på stress 27. Desuden blev samme metode anvendt i undersøgelser, der viser, at proteinet kinase C bii (PKCbII) er rekrutteret til ribosomer ved Racks1 32 og at aktivering af mTOR kompleks 2 (mTORC2) forekommer på ribosomer, hvor det phosphorylates nyligt syntetiserede AKT-polypeptider og regulerer deres stabilitet 33,34.
Store begrænsninger af polysom fraktioneringsmetode efterfulgt af anota analyse er: 1) kravet om et relativt højt antal celler (~ 15 x 10 6 celler), 2) manglende positionsinformation vedrørende lokalisering af ribosomet på et givet mRNA-molekyle, og 3 ) spørgsmål i relation til cellulære og molekylære heterohomogent normale og tumorvæv. Spørgsmål vedrørende krævede celle nummer kan løses ved at tilpasse absorbansspektre toppe svarende til monosomer (80S) af celler, hvis beløbene er begrænsende med dem, der opnås fra high-overflod celler (f.eks HeLa-celler) 35. Ribosom profilering teknik (se nedenfor) kan anvendes til at bestemme nøjagtige position af ribosomet på et givet mRNA-molekyle, mens spørgsmål vedrørende forstyrrende virkninger af væv heterogenitet om fortolkningen af ændringer i genekspression opnået fra komplekse systemer, såsom humane væv diskuteres i detaljer i en publikation fra Leek og Storey 36.
For nylig blev en hidtil ukendt ribosom profilering teknik udviklet, hvor ribosom beskyttede fragmenter (RPFs) genereres ved RNAse I-behandling og analyseret ved dyb-sekventering 22. Denne teknik muliggør bestemmelse af ribosomet position ved et enkelt nucleotid opløsning, for derved at tilvejebringe hidtil unprecedented indsigt i ribosomet biologi. For eksempel kan ribosom profilering, der skal anvendes til bestemmelse af ribosom densitet på et givet mRNA-molekyle eller identifikation af elementer, der påvirker oversættelse ammefrekvensen såsom alternative initierings-sites, initiering ved ikke-august kodoner og regulatoriske elementer, såsom uORFs. Men der er flere metodologiske begrænsninger, der begrænser muligheden for ribosomet profilering til præcist at estimere mRNA translation effektivitet. Disse omfatter uafhængige bias indført ved tilfældig fragmentering og RNAse I fordøjelse, fordomme indført ved translationsinhibitorer (f.eks forlængelsesegenskaber hæmmere såsom emetin og cycloheximid er tilbøjelige til at fremkalde ribosom ophobning ved translationsinitiering sites), et stort antal af falsk positive og falsk negative resultater er forbundet med TE scoringer samt deres unøjagtighed forudsige læser, der stammer fra protein kodning mRNAer 37. Måske vigtigst, hvorimodribosom profilering giver mulighed for direkte identifikation af ribosom stilling på et givet mRNA-molekyle, er antallet af ribosomer, som er forbundet med en given mRNA indirekte estimeret ved at normalisere frekvenser læser i RPFs (ribosom-associeret mRNA) i forhold til dem observeret i tilfældigt fragmenterede mRNAer (total mRNA). For eksempel vil en simpel indstilling, hvor fire "B" mRNA molekyler (BA, som BB, BC og BD) er besat af fire ribosomer på positionerne 1, 2, 3 og 4, en iboende mangel af ribosomet profilering teknik ikke tillade en skelnen mellem et scenarie, hvor alle 4 ribosomer forbinder kun med en Ba mRNA i positionerne 1, 2, 3, og 4, og et scenarie, hvor Ba, Bb, Bc og Bd mRNA hver besat af en enkelt ribosom i position 1, 2 , 3 og 4, hhv. I modsætning hertil, i polysom fraktionering er polysom integritet bevares, hvorved isolering af puljer af mRNA'er, der er forbundet med et defineret antal ribosomer (figur 1). Denne important sondring mellem polysom fraktionering og ribosom profilering antyder, at førstnævnte metode kan bruges til direkte at sammenligne mRNA'er i mRNP, lette og tunge polysom fraktioner sidstnævnte metode vil sandsynligvis ikke at fange ændringer i translatome der er forårsaget af mRNA'er at overgangen fra let til svær polysomer, mens overvurdere bidraget fra dem, der flytter fra mRNP fraktion til tunge polysomer. Den biologiske betydning af disse uoverensstemmelser mellem de førnævnte metoder understreges af en stor mængde data, der viser, at translationel aktivering af en delmængde af mRNA'er, såsom dem, der er eIF4E-følsomme, overgangen fra lys til tunge polysomer, mens andre, såsom dem, der huser 5'TOP elementer, der er rekrutteret til tunge polysomer direkte fra puljer af ribosom-fri mRNA 6. Interessant nok har mTOR blevet vist, at samtidig modulere oversættelse af "eIF4E-følsomme" og 5'TOP mRNA'er 11.. Derfor kan metodologiske forskelle, der er diskuteret ovenfor forklare den tilsyneladende uoverensstemmelse af konklusionen mellem undersøgelser ved hjælp af ribosom profilering 38,39 og polysom fraktionering 24 til at vurdere virkningerne af mTOR hæmning på translatome.
Afslutningsvis polysom fraktionering og ribosom profilering er komplementære metoder, der primært giver oplysninger om antallet af ribosomer associeret med mRNA og placering af ribosomet på mRNA, hhv. Vigtigere er det, trods de mangler og fordele ved disse metoder, er det stadig vigtigt, at de data, genom-dækkende opnået ved begge procedurer er tilstrækkeligt analyseret og funktionelt og biokemisk valideret.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskning blev støttet af den canadiske Institutes of Health Research Grant (CIHR MOP-115195) og FRQ-S til det, der er også en modtager af CIHR Young Investigator Award; og det svenske forskningsråd og den svenske Cancer Society til OL
HEPES | Biobasic | HB0264 | |
MgCl 2 | Sigma | M8266 | |
KCl | VWR | CABDH4532 | |
Dithiothreitol (DTT) | Biobasic | DB0058 | |
Tris | Biobasic | TB0196 | |
Glycoblue | Ambion | AM9515 | RNA precipitation carrier |
Sodium Deoxycholate | Sigma | D6750 | |
Triton X-100 | Sigma | X100 | |
Cycloheximide | Sigma | C1988 | |
Protease inhibitor cocktail | Roche | 04693132001 | Tablets (EDTA-free) |
RNase inhibitor | Promega | N2515 | |
0.45 µm Filter System 150 ml | Corning | 431155 | |
Sucrose | Sigma | S0389 | |
RNeasy MinElute Cleanup kit | Qiagen | 74204 | RNA cleanup kit |
Thin wall polyallomer ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 331372 | |
Equipments | |||
SW41Ti Rotor Package with accessories | Beckman Coulter | 331336 | |
Optima L100 XP ultra centrifuge | Beckman Coulter | DS-9340A | |
ISCO fraction collector | Brandel | FC-176-R1 | |
Type II Detector with Chart Recorder | Brandel | UA-6 | UV detector |
Tube Piercer w/Flow Cell and Syringe Pump | Brandel | BR-A86-5 | |
UA-6 Detector Cable | Brandel | 60-1020-211 | |
FC-176 Communication Cable | Brandel | FCC-176 | |
Gradient Master Base Unit | Biocomp | 108-1 | Gradient Maker |
Gradient Forming Attachments | Biocomp | 105-914A-1R | Gradient Maker attachment |
Measurement Computing 8-channel 50kHz Data Acquisition Device | MicroDAQ | USB-1208FS | Analysis software attachment |
Measurement Computing Data Acquisition Software | MicroDAQ | TracerDAQ Pro | Analysis software (Download only) |
Buffers | |||
10X buffer for sucrose gradients: | |||
200 mM HEPES (pH7.6) | |||
1 M KCl | |||
50 mM MgCl2 | |||
100 µg/ml cycloheximide | |||
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free) | |||
100 units/ml RNase inhibitor | |||
Lysis buffer | |||
5 mM Tris-HCl (pH7.5) | |||
2.5 mM MgCl2 | |||
1.5 mM KCl | |||
1x protease inhibitor cocktail (EDTA-free)] | |||
Then add cycloheximide (CHX), DTT, RNAse inhibitor, Triton and Sodium Deoxycholate as indicated in the main text |