GABAergic presynaptische remming is een krachtig remmend mechanisme op het ruggenmerg belangrijk motorische en sensorische signalen integratie in ruggenmerg netwerken. Onderliggende primaire afferente depolarisatie kan worden gemeten door registratie van de dorsale wortel potentialen (DRP). Hier laten we een methode van in vivo opname van DRP in muizen.
Presynaptische remming is een van de meest krachtige remmende mechanismen in de ruggenmerg. De onderliggende fysiologische mechanisme is een depolarisatie van primaire afferente vezels gemedieerd door GABAergic axo-axonale synapsen (primair afferente depolarisatie). De sterkte van de primaire afferente depolarisatie kan worden gemeten door registratie van volumes uitgevoerd potentialen op de dorsale wortel (dorsale wortel potentialen, DRP). Pathologische veranderingen van presynaptische inhibitie zijn cruciaal in de abnormale centrale verwerking van bepaalde pijn omstandigheden en in sommige aandoeningen van de motor hyperexcitatie. Hier beschrijven we een werkwijze voor opname DRP in vivo in muizen. De voorbereiding van het ruggenmerg dorsale wortels in het verdoofde dier en de opname procedure met behulp van zuig-elektroden worden toegelicht. Deze methode maakt het meten GABAergische DRP en daardoor het schatten van spinale presynaptische remming in de levende muis. In combinatie met transgene muismodellen, kan DRP opname serve als een krachtig instrument om ziekte-geassocieerde spinale pathofysiologie onderzoeken. In vivo opname heeft een aantal voordelen ten opzichte van ex vivo geïsoleerde ruggenmerg voorbereidingen, zoals de mogelijkheid van gelijktijdige opname of manipulatie van supraspinale netwerken en inductie van DRP door stimulatie van perifere zenuwen.
Presynaptische remming is een van de meest krachtige remmende mechanismen in de ruggenmerg. Het remt prikkelende postsynaptische potentialen (EPSPs) in monosynaptically opgewonden motoneuronen zonder de postsynaptische membraan potentieel en de prikkelbaarheid van de motoneuronen 1-3. Primaire afferente depolarisatie (PAD) geïnduceerd door GABAergic axo-axonale synapsen op zintuiglijke presynaptische vezels is het onderliggende mechanisme 4-7 (zie ook Figure1A). Deze synapsen bevatten GABA A-en GABA B-receptoren (GABA A R en R GABA B). GABAA-R activiteit leidt tot een toename van chloride conductantie waarin PAD opwekt wegens lokaal ionenverdeling. Dit depolarisatie blokkeert de propagatie van actiepotentialen in de axon terminals en vermindert de kracht leidt tot een verminderde Ca2 +-influx en een vermindering van de afgifte van transmitter. Activering van GABA B-receptoren zich ert bijdragen aan PAD, maar leidt tot een vermindering van Ca 2 +-influx en zodoende het presynaptische remming. Terwijl de activering van GABA A R lijkt betrokken te zijn bij korte termijn remming, worden GABA B R betrokken bij langdurige modulatie 8-10. Naast GABA, die goed is voor het grootste deel van PAD en presynaptische remming kan andere zenders systemen ook moduleren en bijdragen mechanisme 11,12.
Pathologische veranderingen in presynaptische remming lijkt cruciaal te zijn in verschillende ziektetoestanden bijvoorbeeld perifere ontsteking en neuropathische pijn 13,14, alsook abnormale centrale pijn verwerking 15, ruggenmergletsel 16 en CNS ziekte met motorische hyperexcitatie gemedieerd door defecte GABA-erge transmissie 17, 18. Aldus schatten presynaptische remming nuttig experimentele pathologische condities te bestuderen op het ruggenmerg niveau vivo </em>. PAD leidt tot volume uitgevoerd potentialen die een directe maat van de presynaptische remming in het ruggenmerg. Die mogelijkheden zijn dorsale wortel potentials (DRP) genoemd en kan worden gemeten uit het ruggenmerg dorsale wortels na stimulatie van aangrenzende dorsale wortels 7.
Eerste metingen van DRP zijn gemeld bij katten en kikkers 19 en werden intensief bestudeerd bij katten door Eccles, Schmidt en anderen in de vroege jaren 1970 3,4,20,21. Terwijl in vivo opnames van DRP bij katten 22 pt 23 ratten zijn op grote schaal gebruikt, metingen in muizen zijn bijna uitsluitend uitgevoerd in ex vivo geïsoleerde ruggenmerg voorbereidingen 15,24. Hier beschrijven we een methode om DRP nemen in verdoofde muizen in vivo waardoor een directe meting van presynaptische remming in het intacte organisme.
Extra-en intracellulaire elektrofysiologische opnames van neuronale activiteit en synaptische potentialen in vivo zijn state of the art technieken in onderzoek CNS neuronale functies en pathofysiologie. Spinal integratie is van cruciaal belang voor de motoriek, zoals beweging van de ledematen en voor multimodale zintuiglijke waarneming. Presynaptische remming is een cruciaal mechanisme in deze computationele proces zorgen voor een passende reacties op zintuiglijke input. GABAergic synapsen op Ia affere…
The authors have nothing to disclose.
Wij danken Manfred Heckmann voor nuttige discussies tijdens vaststelling van de methode. Verder bedanken we Claudia Sommer voor technische bijstand en Frank Schubert voor ondersteuning produceren van de video. Het werk werd ondersteund door het ministerie van Onderwijs en Onderzoek (BMBF), Duitsland, FKZ: 01EO1002 en het Interdisciplinair Centrum voor Klinisch Onderzoek (IZKF) van Jena University Hospital.
Glass tubing (inner diameter 1.16 mm) | Science Products (Hofheim, Germany) | GB200F-10 | Other glass tubing might also be suitable |
Superfusion solution (sterile, 0,9% NaCl) | Braun Melsungen AG | 3570350 | |
(Melsungen, Germany) | |||
Rompun 2% (Xylazine) | Bayer Animal Health GmbH (Leverkusen, Germany) | ||
Ketamin 10% | Medistar GmbH (Ascheberg, Germany) | KETAMIN 10% | |
30G micro needle/ Sterican | Braun Melsungen AG | 4656300 | |
(Melsungen, Geramny) | |||
Salts for aCSF | Sigma-Aldrich | Diverse | |
S88 Dual Output Square Pulse | Grass Technologies (Warwick, USA) | S88X | |
Stimulator | |||
SIU5 RF Transformer Isolation Unit | Grass Technologies (Warwick, USA) | SIU-V | |
InstruTECH LIH 8+8 | HEKA (Lambrecht, Deutschland) | LIH 8+8 + Patchmaster software | |
Data acquisition | |||
Universal amplifier | npi (Tamm, Deutschland) | ELC-03X | |
Micropipette puller | Sutter Instruments (Novato, USA) | P-1000 | |
Dissecting microscope | Olympus (Tokyo, Japan) | ||
Micromanipulator | Sutter Instruments (Novato, USA) | MPC-200/MPC-325 | Mechanical micromanipulators also possible |
Homeothermic Blanket System | Stoelting (Wood Dale, USA) | 50300V | |
Intra-/extracellular recording electrode holder | Harvard Apparatus (Holliston, USA) | 641227 |