चार आयामी प्रतिदीप्ति इमेजिंग के साथ तंत्रिका टर्मिनलों के रहने में endosome गतिशीलता के दृश्य
Summary
चार आयामी (4D) इमेजिंग हड्डीवाला तंत्रिका टर्मिनलों में रहने वाले endosomes के दो प्रकार के बीच व्यवहार और बातचीत का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. इन छोटे संरचनाओं का आंदोलन ऐसी endosome फ्यूजन और एक्सोसाइटोसिस रूप में की घटनाओं की पुष्टि की अनुमति, तीन आयामों में विशेषता है.
Abstract
गेटिस साँप की मांसपेशी Abdominis चार आयामी (4D) प्रकाश इमेजिंग पतली transversus की मोटर तंत्रिका टर्मिनलों के भीतर छोटे संरचनाओं के व्यवहार का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. कच्चे डेटा 3D Z-ढेर के समय चूक दृश्यों शामिल हैं. प्रत्येक स्टैक 400-1,500 एनएम द्वारा अलग फोकल विमानों पर epifluorescence प्रकाशिकी के साथ प्राप्त कर लिया 4-20 चित्र शामिल हैं. इस तरह के ध्यान के समायोजन के रूप में छवि के ढेर, के अधिग्रहण में कदम, उत्तेजना तरंग दैर्ध्य की स्विचिंग, और डिजिटल कैमरा के आपरेशन, छवि दर को अधिकतम और प्रकाश जोखिम से ऊतकों को नुकसान को कम करने के लिए संभव के रूप में ज्यादा के रूप में स्वचालित रहे हैं. अधिग्रहण के बाद, छवि के ढेर का एक सेट स्थानिक संकल्प में सुधार के लिए deconvolved है, वांछित 3 डी स्वरूप में परिवर्तित, और एक 4D "फिल्म" कि मांग की प्रयोगात्मक डेटा पर निर्भर करता है, कंप्यूटर आधारित विश्लेषण की विविधता के लिए उपयुक्त है बनाने के लिए इस्तेमाल किया. One आवेदन तंत्रिका टर्मिनलों-macroendosomes में पाया endosomes के दो वर्गों (एमईएस) के गतिशील व्यवहार का अध्ययन हैऔर (एईएस) जिसका आकार (दोनों प्रकार के लिए 200-800 एनएम) अम्लीय endosomes विवर्तन सीमा पर या पास हैं. हर समय बिंदु पर 3 डी सूचना तक पहुंच परम्परागत समय चूक इमेजिंग पर कई लाभ प्रदान करता है. विशेष रूप से, आकार और संरचनाओं के आंदोलन का वेग तेज ध्यान की हानि के बिना समय के साथ मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. 4D इमेजिंग से डेटा के उदाहरणों में वे exocytosed बजाय बस खड़ी दूर ध्यान देने का एक ही विमान से आगे बढ़ रहे हैं, सुझाव है कि एमईएस प्लाज्मा झिल्ली दृष्टिकोण और गायब हो जाते हैं कि पता चलता है. इसके अलावा प्रत्येक तीन orthogonal के अनुमानों में देखा के रूप में दो डाई युक्त संरचनाओं के बीच ओवरलैप के दृश्य से एमईएस और एईएस के ख्यात फ्यूजन है, का पता चला.
Introduction
ऊतक रहने के समय चूक इमेजिंग समय में एक ही बिंदु पर imaged निश्चित या रहने तैयारी में सराहना नहीं की जा सकती कि dynamical संरचना समारोह संबंधों के लिए दृश्य पहुँच प्रदान करता है. अक्सर बहरहाल, लौकिक जानकारी के लिए उपयोग के लिए tradeoff ऑप्टिकल संकल्प में कमी है. उच्च संख्यात्मक एपर्चर तेल विसर्जन उद्देश्यों को ही विकल्प के रूप में पानी विसर्जन या सूखी उद्देश्यों को छोड़ रहा है, क्योंकि फोकस के अपने सीमित दायरे के रहने वाले ऊतक में अव्यावहारिक है. इसके अलावा, confocal प्रकाशिकी द्वारा सकती वृद्धि के प्रस्ताव रोशनी के अपेक्षाकृत उच्च स्तर 1,2 आवश्यकता से phototoxicity के कारण कुछ जीने की तैयारी में उपयोग नहीं किया जा सकता. कई वास्तविक समय या समय चूक ऑप्टिकल तकनीक है कि प्रस्ताव बढ़ाया संकल्प उपलब्ध हैं, जबकि अन्त में, जो उनकी प्रयोज्यता ब्याज की संरचनाओं उद्देश्य 1 से कुछ सौ नैनोमीटर के भीतर तैनात किया जा सकता है, जहां तैयारी तक सीमित है. वर्णित विधि, अपेक्षाकृत कम कीमत वाले उपकरणों का उपयोग करता है बहुमुखी है, अभी तक अधिक सामान्य रूप से प्रयुक्त समय व्यतीत तकनीक की तुलना में सुधार के प्रस्ताव प्रदान करता है. यह व्यक्तिगत प्रयोगशालाओं के साथ ही इमेजिंग सुविधाओं में उपयोग के लिए है.
विधि एक संवेदनशील डिजिटल कैमरा के साथ और तेजी से थोड़ा अलग फोकल विमानों (z-ढेर) में छवियों के सेट प्राप्त करने के लिए हार्डवेयर डिजाइन के साथ संयुक्त, पारंपरिक epifluorescence माइक्रोस्कोपी का इस्तेमाल करता. प्रत्येक z ढेर डिजिटली संकल्प को बढ़ाने के लिए deconvolved है. 3D समय चूक (4D) इमेजिंग की एक विशेषता यह organelles या अन्य संरचनाओं को हिलाने की सटीक ट्रैकिंग है. ठीक से सेट किया है, imaged संरचनाओं ध्यान से बाहर जाना नहीं है, और सभी तीन दिशाओं में आंदोलन मनाया और मात्रा निर्धारित किया जा सकता है. एक दाग संरचना केवल एक संकीर्ण फोकल हवाई जहाज़ के ऊपर या नीचे बहती से एक या एक से अधिक समय व्यतीत हो जाने के तख्ते पर गायब करने के लिए इस प्रकार यह असंभव है. विधि भी बातचीत और संभव फू का आकलन करने के लिए एक संवेदनशील उपकरण के रूप में कार्य करता हैछोटे संरचनाओं के सायन. परम्परागत epifluorescence या सीमा विवर्तन (कुछ सौ एनएम) के पास संरचनाओं के confocal छवियों विलय कर छवियों उनके संबंधित लेबल 3 के ओवरलैप दिखाने भले ही फ्यूजन की पुष्टि नहीं करते. फ्यूजन का सुझाव दिया, लेकिन यह वस्तुओं विवर्तन सीमा से नीचे है कि एक दूरी से क्षैतिज या खड़ी अलग हो रहे हैं कि संभव बना रहता है. तीन या चार आयामी इमेजिंग, इसके विपरीत, तीन orthogonal दिशाओं में से प्रत्येक में वस्तुओं को देखने के लिए परमिट. सभी तीन दृश्यों में संलयन की उपस्थिति निश्चितता के स्तर बढ़ जाता है. और, कुछ जीने की तैयारी में, निर्देशित या दोनों लेबल समय में एक साथ ले जाने पर कथित रूप से जुड़े हुए वस्तुओं की ब्राउनियन आंदोलन आगे सबूत प्रदान करता है. बेशक, जब विवर्तन सीमा के निकट पृष्ठभूमि से समझदार संरचनाओं में निश्चितता, या वे दो रंगों (फ्यूजन) होते हैं कि दिखाने का स्तर, निरपेक्ष नहीं है. अगर इस तरह के प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) के रूप में लागू हो, विशेष तकनीक,4, अधिक उपयुक्त हैं.
Protocol
Representative Results
Discussion
4D इमेजिंग का सबसे महत्वपूर्ण पहलू प्रकाश जोखिम की अवधि और तीव्रता का प्रबंधन है. Photobleaching छवि संकेत करने वाली शोर अनुपात कम हो जाती है और fluorophores के चुनाव सहित विभिन्न कारकों पर निर्भर करता है समस्याग्रस्त य?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम के स्वास्थ्य ग्रांट एन एस-024572 (RSW के लिए) के अमेरिकी राष्ट्रीय संस्थानों द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
References
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