Visualisering av endosome Dynamics i Living nervterminaler med Fyrdimensionell fluorescens avbildning
Summary
Fyrdimensionell (4D) avbildning används för att studera beteende och samspel mellan två typer av endosomes i levande ryggradsdjur nervterminaler. Förflyttning av dessa små strukturer kännetecknas av tre dimensioner, som medger bekräftelse av händelser såsom endosome fusion och exocytos.
Abstract
Fyrdimensionell (4D) ljus bildbehandling har använts för att studera beteendet hos små strukturer inom motoriska nervterminaler i den tunna transversus abdominis muskeln i garterorm. Rådata består av tidsförlopp sekvenser av 3D-z-stackar. Varje bunt innehåller 4-20 bilder som förvärvats med epifluorescence optik vid fokalplan åtskilda av 400-1,500 nm. Stegen i förvärvet av bildstaplar, såsom justering av fokus, omkoppling av excitationsvåglängder, och drift av den digitala kameran, är automatiserade så mycket som möjligt för att maximera bildhastighet och minimera vävnadsskador från ljusexponering. Efter förvärvet, har en uppsättning av bildstaplar dekonvolvering att förbättra rumslig upplösning, omvandlas till önskat 3D-format, och används för att skapa en 4D "film" som är lämplig för olika datorbaserade analyser, beroende på de experimentella data som eftersträvas. En tillämpning är studiet av det dynamiska beteendet hos två klasser av endosomes som finns i nervterminaler-macroendosomes (MES)och sura endosomer (AES)-vars storlek (200-800 nm för båda typerna) är vid eller nära diffraktionsgränsen. Tillgång till 3D-information vid varje tidpunkt ger flera fördelar jämfört med konventionell time-lapse avbildning. I synnerhet kan storleken och hastigheten hos rörelsen hos strukturerna kvantifieras över tid utan förlust av skärpa. Exempel på data från 4D avbildning avslöjar att ME närma plasmamembranet och försvinna, vilket tyder på att de är exocytosed snarare än att helt enkelt flytta sig vertikalt bort från ett enda plan i fokus. Dessutom avslöjas är förmodade fusion av MES och biverkningar, genom visualisering av överlappning mellan de två färgämnesinnehållande strukturer som visade i vardera tre ortogonala projektioner.
Introduction
Time-lapse avbildning av levande vävnad ger visuell tillgång till dynamiska struktur-funktions relationer som inte kan uppskattas i fasta eller levande förberedelser avbildas vid en enda tidpunkt. Ofta är dock den avvägning för tillträde till temporal information som en minskning i optisk upplösning. Höga olje-nedsänkning mål numerisk bländare är opraktiska i levande vävnad på grund av deras smalt fokus, lämnar nedsänkning i vatten eller torra mål som de enda alternativen. Dessutom kan den ökade upplösningen ges genom konfokala optiken inte utnyttjas i vissa levande preparat på grund av fototoxicitet från de relativt höga nivåer av belysning som krävs 1,2. Slutligen, medan flera realtid eller time-lapse optiska tekniker finns tillgängliga som erbjuder förbättrad upplösning, är deras användbarhet begränsad till förberedelser där strukturer av intresse kan placeras inom ett par hundra nanometer i mål 1. Den beskrivna metodenanvänder sig av förhållandevis billig utrustning, är mångsidig, men ändå erbjuder förbättrad upplösning jämfört med mer ofta använda tidsförlopp tekniker. Den är avsedd att användas i enskilda laboratorier samt avbildningsfaciliteter.
Metoden utnyttjar konventionell epifluorescensmikroskopi, i kombination med en känslig digitalkamera och med hårdvara som designats för att snabbt erhålla uppsättningar av bilder med något olika fokalplan (z-stackar). Varje z-stack är digitalt dekonvolvering för att öka upplösningen. Ett inslag i 3D tidsförlopp (4D) imaging är exakt spårning av rörliga organeller eller andra strukturer. När rätt inställd behöver avbildade strukturer inte gå ur fokus, och rörelse i alla tre riktningar kan observeras och kvantifieras. Därför är det omöjligt för en färgade struktur att försvinna över en eller flera tidsförlopp ramar enbart genom drifting över eller under en smal fokalplan. Metoden fungerar också som ett känsligt verktyg för att bedöma samspelet och eventuella fusion av små strukturer. Konventionell epifluorescence eller konfokala bilder av strukturer nära diffraktionsgränsen (några hundra nm) inte bekräfta fusion även om sammanslagna bilder visar överlappning av deras respektive etiketter 3. Fusion föreslås, men det är fortfarande möjligt att föremålen är åtskilda horisontellt eller vertikalt med ett avstånd som är mindre än diffraktionsgränsen. Tre eller fyra-dimensionell avbildning, i motsats härtill medger visning av objekt i var och en av tre ortogonala riktningar. Uppträdandet av fusion i alla tre vyer ökar nivån av säkerhet. Och i vissa levande preparat, riktade eller Brownsk rörelse förment smält föremål ger ytterligare bevis när båda etiketterna flyttar ihop i tid. Naturligtvis, när nära diffraktionsgränsen nivån av säkerhet i krävande strukturer från bakgrunden, eller visar att de innehåller två färgämnen (fusion), är inte absolut. I tillämpliga fall, specialiserade tekniker, såsom fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)4, är lämpligare.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den mest kritiska aspekten av 4D avbildning är hanteringen av varaktighet och intensitet ljusexponering. Fotoblekning minskar bild signal-till-brus-förhållande och kan vara problematiskt eller inte beroende på olika faktorer, bland annat val av fluoroforer. Icke-specifik skada på levande vävnad (fototoxicitet) är relaterad till fotoblekning, och kan ibland identifieras med hjälp av fluorescerande prober som utformats för ändamålet 2,12 eller genom undersökning av morfologi med lämpliga bright opt…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health Grant NS-024.572 (till RSW).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents: | |||
| SGC5 | Biotium [Hayward, CA] | 70057 | Final conc:10 mM |
| FM1-43FX | Invitrogen [Carlsbad, CA] | F35335 | Final conc:7 mM |
| LysoTracker Red | Invitrogen [Carlsbad, CA] | L7528 | Final conc:0.2 mM |
| Solutions: | |||
| Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2.5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High KCL Reptilian Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 86 mM | ||
| KCl | 60 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| High Sucrose Ringers pH 7.2 | |||
| NaCl | 145 mM | ||
| KCl | 2. 5 mM | ||
| CaCl2 | 3.6 mM | ||
| MgSO4 | 1.8 mM | ||
| KH2PO4 (Dibasic) | 1.0 mM | ||
| HEPES | 5.0 mM | ||
| Sucrose | 0.5 M (17.1 gm/50 mL) | ||
| Equipment: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Axioplan 200 inverted microscope | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| N-Achroplan 63X water objective; n.a.=0.9; Working distance=2.4mm | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | www.zeiss.com | |
| DG4 combination light source/excitation filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | 175W Xenon arc lamp | www.sutter.com |
| Lambda 10-2 emission filterwheel switcher | Sutter instruments [Novato, CA] | www.sutter.com | |
| Sensicam CCD camera | Cooke Instruments [Tonawanda, NY] | www.cookecorp.com | |
| Cascade 512 CCD camera | Photometrics [Tucson, AZ] | www.photometrics.com | |
| Imaging dishes- made in-house-11cm dia.; 25 mm dia. #1 coverslip embedded; magnetic pins | |||
| Software: | |||
| Name | Company | Comments | Comments(website) |
| Slidebook 5.0 | Intelligent Imaging Innovations [Denver, CO] | Deconvolution; Drift correction;3D and 4D data presentation | www.intelligent-imaging.com |
| IMARIS 7.5.2 | Bitplane [South Windsor, CT] | Drift correction; 3D and 4D data presentation | www.bitplane.com |
| AfterEffects CS6 | Adobe [San Jose, CA] | Drift correction | www.adobe.com |
| ImageJ 1.46 | National Institutes of Health [Bethesda, MD] | Multiple plugins available;Stereo pair construction | http://rsbweb.nih.gov/ij |
| Zeiss LSM | Carl Zeiss [Thornwood, NY] | Stereo pair construction | www.zeiss.com |
References
- Frigault, M. M., Lacoste, J., Swift, J. L., Brown, C. M. Live-cell microscopy-tips and tools. J. Cell Sci. 122 (6), 753-767 (2009).
- Tinevez, J. -. Y., et al. A quantitative method for measuring phototoxicity of a live cell imaging microscope. Meth. Enzymol. 506, 291-309 (2012).
- Dunn, K. W., Kamocka, M. M., McDonald, J. H. A practical guide to evaluating colocalization in biological microscopy. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 300, (2011).
- Snapp, E. L., Hegde, R. S. Rational design and evaluation of FRETexperiments to measure proteinproximities in cells. Curr. Protoc. Cell Biol. 17, (2006).
- Stewart, R. S., Teng, H., Wilkinson, R. S. Late” macroendosomes and acidic endosomes in vertebrate motor nerve terminals. J. Comp. Neurol. 520, 4275-4293 (2012).
- Teng, H., Lin, M. Y., Wilkinson, R. S. Macroendocytosis and endosome processing in snake motor boutons. J. Physiol. 582, 243-262 (2007).
- McNally, J. G., Karpova, T., Cooper, J., Conchello, J. A. Three-dimensional imaging by deconvolution microscopy. Methods. 19, 373-385 (1999).
- Swedlow, J. R., Platani, M. Live cell imaging using wide-field microscopy and deconvolution. Cell Struct. Funct. 27, 335-341 (2002).
- Cromey, D. W., Taatjes, D. J., Roth, J. Digital images are data: and should be treated as such. Methods Mol. Biol. 931, 1-27 (2013).
- Teng, H., Wilkinson, R. S. Clathrin-mediated endocytosis near active zones in snake motor terminals. J. Neurosci. 20 (21), 7986-7993 (2000).
- Teng, H., Cole, J. C., Roberts, R. L., Wilkinson, R. S. Endocytic active zones: hot spots for endocytosis in vertebrate nerve terminals. J. Neurosci. 19 (12), 4855-4866 (1999).
- Tan, T. T. T., Khaw, C., Ng, M. M. L., Mendez-Vilas, A., Diaz, J. Challenges and recent advances in live cell bioimaging. Microscopy: Science, Technology, Applications and Education. , 1495-1505 (2010).
- Verbrugghe, K. J. C., Chan, R. C. Imaging C. elegans embryos using an epifluorescent microscope and open source software. J. Vis. Exp. (49), (2011).
