Spinal Cord doorsnijding in het larvale zebravis

Summary

Na spinale doorsnijding, volwassen zebravissen hebben functioneel herstel van zes weken na het letsel. Om te profiteren van larvale transparantie en sneller herstel nemen, presenteren we een methode voor het doorsnijden van de larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, zien we zintuiglijke herstel vanaf 2 dagen na het letsel, en C-bocht beweging door 3 dagen na het letsel.

Abstract

Zoogdieren falen in sensorische en motorische herstel na dwarslaesie door gebrek aan axonale hergroei onder het niveau van zowel de schade als een onvermogen om spinale neurogenese hervatten. Sommige anamniotes waaronder de zebravis Danio rerio vertonen zowel sensorische en functioneel herstel zelfs na volledige doorsnijding van het ruggenmerg. De volwassen zebravis is een gevestigde modelorganisme voor het bestuderen van regeneratie na dwarslaesie, met sensorische en motorische herstel van 6 weken na het letsel. Om te profiteren van in vivo analyse van het regeneratieve proces in de transparante larvale zebravis en genetische hulpmiddelen niet in de volwassen toegankelijke nemen, gebruiken we de larvale zebravis regeneratie studie na ruggenmerg doorsnijding. Hier laten we een methode voor het reproduceerbaar en verifieerbaar transecting het larvale ruggenmerg. Na doorsnijding, uit onze gegevens blijkt zintuiglijke recovery begin op 2 dagen na het letsel (dpi), with de C-bocht beweging detecteerbaar met 3 dpi en hervatting van de gratis zwemmen met 5 dpi. Zo stellen wij de larvale zebravis als een metgezel instrument om de volwassen zebravissen voor de studie van herstel na dwarslaesie.

Introduction

Belangrijke trauma aan het menselijke ruggenmerg resulteert vaak in permanente verlamming en gevoelsverlies onder het niveau van schade als gevolg van het onvermogen om axons teruggroeien of hervatten neurogenese ^1,2. In tegenstelling tot zoogdieren, echter anamniotes waaronder salamanders en zebravis (Danio rerio) tonen krachtig herstel, zelfs na volledige ruggenmerg doorsnijding ^3,4.

De volwassen zebravis is een goed uitgewerkt model voor het bestuderen van het herstelproces na dwarslaesie ^5-7. Na volledige ruggenmerg doorsnijding, is herstel van sensorische en locomotief functie waargenomen in de volwassen zebravissen met 6 weken na het letsel ^8. Om het regeneratieve proces in vivo onderzoeken we kwamen de transparante larvale zebravis ^9.

Hier presenteren we een methode om het ruggenmerg van een 5 dagen na de bevruchting (DPF) larvale zebravis usi doorsnijdenng een afgeschuinde micro-injectie pipet als een scalpel, gewijzigd van Bhatt, et al.. ¹⁰ Deze methode ondersteunt high throughput, lage sterfte en reproduceerbaarheid. Met de praktijk, kan 300 larven / uur worden doorsneden, en meer dan 6 maanden van doorsnijdingen, waaronder meer dan 3600 dieren, 98.75% ± 0,72% overleefde tot 7 dagen na het letsel (dpi). Onze gegevens blijkt snel herstel van de sensorische en motoriek ook: op 1 dpi, wordt alle verkeer door de gewonde vis gedreven door slechts borstvin motoriek. Echter, larven beginnen te reageren op de naald contact caudaal wolfraam te doorsnijden met 2 dpi, herstel de C-bocht beweging door 3 dpi, en weer roofzuchtige zwemmen met 5 dpi ^11. Met behulp antilichaamkleuring tegen geacetyleerd tubuline, hebben we bevestigd dat axonen afwezig zijn van het letsel site op 1 dpi, maar het letsel website hebben doorkruist door 5 dpi. Wij geloven dat dit protocol een waardevolle methode voor de studie van axonale hergroei en neurogenese in het ruggenmerg na verwonding. </p>

Protocol

Zebravis zijn gerezen en gefokt volgens standaardprocedures; experimenten werden goedgekeurd door de Universiteit van Utah Institutional Animal Care en gebruik Comite. 1. Voorbereiding van de Chirurgie Platen Maak chirurgie platen met behulp van 60 mm petrischaaltjes en Sylgard 184 siliconelastomeerfase Kit, na instructies van de fabrikant. Vul gerechten hoogste halfvol en laten polymeriseren. Opslag bij kamertemperatuur. 2. Bereiding van micropipe…

Representative Results

Om de ernst van de beschadiging van het weefsel rondom de verwonding te verminderen, een goede afschuining van de micropipet is van cruciaal belang. Figuur 1A toont een correct afgeschuinde punt. Het gebruik van een tip die te breed (figuur 1B) meestal in hogere doden vanwege de verhoogde kans op knikken de dorsale aorta, terwijl een tip die te smal (figuur 1C) neigt blik van de huid in plaats van snijden weefsel. Om deze techniek te oefenen…

Discussion

Bij de eerste leren van deze techniek, raden we proberen niet meer dan 50-100 doorsnijdingen in een enkele sessie. Na het beheersen van deze techniek zijn we in staat om het doornemen tot 300 embryo's per uur; echter, dit niveau van throughput vereist een paar maanden van wekelijkse praktijk. We raden ook aan het oefenen met een verslaggever lijn en verifiëren volledige doorsnijding tot de incidentie van onvolledige ruggenmerg doorsnijding wordt teruggebracht tot minder dan 1%.

Ruggenme…

Materials

Name of Material/ Equipment	Company	Catalog Number	Comments/Description
60mm petri dish	VWR	82050-544
100mm petri dish	VWR	89038-968
Sylgard 184 Silicone Elastomer Kit	Fisher Scientific	NC9644388
borosilicate capillary tubing: OD 1.00mm ID 0.78mm	Warner Instruments Inc.	64-0778
forceps	Fine Scientific Tools Inc.	11252-30
disssection microscope	Nikon	SMZ6454
microgrinder	Narishige	EG-44
Gentamycin Sulfate	Amresco Inc.	0304-5G	dissolve in water 10mg/ml, store at -20°C
Tricaine	Acros Organics	118000100
cotton tipped applicator, wood, 6-inch	Fisher Scientific	23-400-101
1ml syringe	BD	309625
27 ga. needle	BD	305109
Fry food	Argent Labs	F-ARGE-PTL-CN	store at -20°C
micropipette puller	Sutter Instrument Co.	Model P-97	Box Filament FB330B
20x E2 (1L)			store at RT
17.5g NaCl	Fisher Scientific	S671-500
0.75g KCl	Fisher Scientific	P217-500
2.90g CaCl2·2H2O	Sigma	C7902-500G
4.90g MgSO4·7H2O	Merck	MX0070-1
0.41g KH2PO4	Fisher Scientific	P285-500
0.12g Na2HPO4	Sigma	S0876-500G
500x NaCO3 (10ml)			make fresh, discard extra
0.35g NaCO3	Sigma	S5761
1x E2 (1L)			store at RT
50ml 20x E2
2ml fresh 500x NaCO3