Une modification<em> In vitro</em> Invasion Test pour déterminer le rôle potentiel des hormones, des cytokines et / ou facteurs de croissance dans le cancer Médiation invasion cellulaire

Summary

This video article describes a modified in vitro method to examine the role of hormones, cytokines and/or growth factors in driving cancer cell invasion.

Abstract

Le sérum sanguin sert de chimioattractant vers laquelle les cellules cancéreuses migrent et envahissent, ce qui facilite leur intravasation en microvaisseaux. Cependant, les molécules réelles vers lequel les cellules migrent demeurent insaisissables. Ce test d'invasion modifié a été mis au point pour identifier les cibles qui entraînent la migration et l'invasion cellulaire. Cette technique compare l'indice d'invasion dans trois conditions pour déterminer si une hormone spécifique, le facteur de croissance ou cytokine joue un rôle dans la médiation le potentiel invasif d'une cellule cancéreuse. Ces conditions comprennent i) de sérum fœtal bovin normal (FBS), ii) charbon-FBS (CS-FBS), qui supprime les hormones, les facteurs de croissance et des cytokines et iii) molécule CS-FBS + (notée "X"). Un changement important dans l'invasion des cellules CS-FBS avec par rapport à FBS, indique l'implication des hormones, des cytokines ou des facteurs de croissance dans la médiation de la modification. Les molécules individuelles peuvent ensuite être ajoutés revenir à CS-FBS pour doser leur capacité à reverset ou sauver le phénotype d'invasion. En outre, deux ou plusieurs éléments peuvent être combinés pour évaluer l'effets additifs ou synergiques de plusieurs molécules dans la conduite ou l'inhibition de l'invasion. Dans l'ensemble, ce procédé permet au chercheur de déterminer si les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance / ou jouent un rôle dans l'invasion cellulaire en agissant comme agents chimio-attractifs ou des inhibiteurs de l'invasion d'un type particulier de cellule cancéreuse ou un mutant spécifique. En identifiant chimiotactiques et des inhibiteurs spécifiques, ce dosage d'invasion modifié peut aider à élucider les voies qui dirigent l'invasion des cellules du cancer de signalisation.

Introduction

Un nouveau dosage d'invasion a été développé dans le but d'identifier l'implication de certaines hormones, des cytokines et / ou facteurs de croissance chimiotactiques comme dans l'invasion des cellules cancéreuses. La capacité des cellules tumorales à envahir à travers la matrice extracellulaire (ECM) est une caractéristique du phénotype métastatique ^3.1. chambres d'invasion ont été largement utilisés comme outils pour étudier in vitro l'invasion des cellules cancéreuses et la migration et peuvent fournir des connaissances sur les mécanismes de l'invasion et la métastase tumorales in vivo. Les chambres sont constituées d'inserts de culture de cellules cylindriques emboîtés dans les puits de plaques de culture de cellules. Le fond des inserts en polycarbonate ou polystyrène sont des membranes semi-perméables des tailles de pores définies.

Dans l'essai d'invasion standard, les cellules sont ensemencées sur la membrane de l'insert avec du milieu sans sérum et on les place dans des puits de culture de cellules qui sont remplis de sérum ou de sérum comme agents chimio-attractifs pour set jusqu'à un chimioattractives vigueur. Cela conduit de force cellules de se déplacer à travers la membrane semi-perméable (migration) ou encore, par un revêtement de la matrice extracellulaire (invasion), qui peut ensuite être teinté avec des colorants classiques pour détecter et quantifier le nombre de cellules. Le nombre de cellules est ensuite normalisée en fonction de l'étendue de la migration et de l'invasion dans une lignée cellulaire non invasive. Cette méthode permet à un chercheur d'évaluer le potentiel invasif de différents types de cellules dans une variété de conditions, y compris les manipulations génétiques.

Les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance sont des éléments essentiels de sérum et sont représentés plus en plus à être associé à l'entraînement du phénotype invasif ^4. Cependant, la nature, le rôle et la spécificité de ces molécules sériques chimioattractives dans la médiation invasion encore demeurent insaisissables. Le défi reste à déterminer quels facteurs spécifiques dans le sérum ou de sérum comme chimioattractifs sont responsables de la conduiteinvasion des cellules cancéreuses ainsi que des molécules qui peuvent inhiber le processus d'invasion. Dans ce rapport, nous décrivons une méthodologie pour évaluer l'implication potentielle des hormones, des cytokines et / ou facteurs de croissance présents dans le sérum, en tant que molécules de conduire l'chimioattraction et l'invasion des cellules cancéreuses.

Dans ce protocole modifié proposé, le charbon de décapage est utilisé pour éliminer les hormones, les cytokines et les facteurs de croissance de 2% de sérum bovin fœtal (FBS) pour générer 2% FBS charbon de bois (CS-FBS). Les deux 2% de FBS et 2% CS-FBS sont utilisés comme agents de mettre en place la force chimioattractives à conduire l'invasion des cellules cancéreuses. Utilisation de 2% de CS-FBS comme agent chimio-attractifs par rapport à la normale 2% de FBS offre plusieurs avantages, y compris d'une part, et le plus en évidence, la possibilité d'étudier le phénotype d'invasion du cancer en l'absence réduit / relative des hormones, des cytokines et des facteurs de croissance. Il permet également à l'enquêteur de déterminer si l'élimination collective des hormones, facteurs de croissance, et CYtokines entraîne une augmentation ou diminution de l'indice invasive. Le dosage est alors conçue pour déterminer si l'addition d'un composant individuel, désignée comme «X» peut inhiber, diminuer, augmenter ou rétablir l'indice invasive à sa valeur initiale (voir les figures 2 et 3). Bien que cette méthodologie est spécifique pour atteindre les niveaux physiologiques de l'élément qui est éliminée à partir du sérum au cours de charbon décapage, il convient également de noter que le charbon de décapage peut aussi affecter les voies de transduction du signal. Par exemple, il a été rapporté que le charbon de décapage peut diminuer l'activité de la phosphatase alcaline de cellules ostéoprogénitrices et induire l'adipogenèse par la réduction des activateurs de ⁵ MAPK. Charcoal médias dénudées sont commercialement disponibles et sont basés sur le protocole décrit qui combine charbon dextran et incubées avec du sérum fœtal bovin O / N ^6.

Cet essai a été développé en Response à un résultat rapporté par Zucker et al. ⁷ Les auteurs ont démontré que le phénotype mutant affectant une communication écart de jonction fait preuve d'une augmentation de l'indice d'invasion lors de la migration vers la normale médias avec 2% de FBS. Cette augmentation a été éliminée avec le remplacement de sérum de charbon-dépouillé. De ce fait, les auteurs ont conclu que ce mutant affecté migration vers une molécule lipophile (plus spécifiquement, une hormone, un facteur de croissance ou cytokines) ^7. Il est bien connu que les hormones, facteurs de croissance, cytokines et médiateurs voies impliquées dans la promotion de la tumeur et invasion ^quatre signalisation. Ainsi, il est important pour les chercheurs scientifiques pour déterminer quel facteur (s) sont le moteur de l'invasion tumorale des cellules cancéreuses ou des mutants particulier à l'étude. L'essai est conçu pour examiner le rôle des composants individuels lors de leur concentration physiologique telle que déterminée en fonction de la différence entre la concentration du composant et# 8220; X "dans FBS normale et le CS-FBS. Grâce au développement de ce test, les enquêteurs peuvent gagner plus de perspicacité dans la voie invasive spécifique régissant leur système.

Des hormones, des facteurs de croissance, cytokines et ont souvent été considérés comme des promoteurs de tumeurs ^8. Certains de ces facteurs tels que EGF sont utilisés comme sources directes pour chimioattractifs dans des chambres d'invasion ^neuf. Ainsi, il semble probable que ceux-ci représentent les principales composantes du sérum qui invasion tumorale directe. Ce protocole propose un moyen simple, mais significative, de la modification de l'essai in vitro classique dans d'invasion qui permet à un chercheur pour évaluer l'implication des hormones, des facteurs de croissance, des cytokines dans la médiation et le potentiel invasif des cellules cancéreuses. Cependant, le test est conçu pour fournir à l'enquêteur une réponse quant à savoir si la procédure sera efficace pour leur étude à une étape précoce dans l'analyse, afin de ne pas utiliser un temps précieux et ressources si jugées inutiles. Cette méthode utilise CS-FBS et se appuie sur la discrétion des enquêteurs à laquelle les molécules de poursuivre en tant que candidats de plomb qui interviennent potentiellement invasion des cellules cancéreuses. Les résultats de ces analyses devraient se avérer utiles dans l'identification des composants du sérum qui servent d'agents chimio-attractifs ou des inhibiteurs de la lignée cellulaire particulière ou un mutant de l'étude. En outre, cette approche peut aider l'enquêteur d'identifier les voies de signalisation clés soit favoriser ou inhiber l'invasion des cellules cancéreuses; dirigeant ainsi l'avenir la conception de médicaments.

Protocol

1. Préparer les différents médias et Composants supplémentaires Avant l'expérience, préparer des milieux consistant en DMEM ou un autre support spécifiés avec l'addition de FBS soit normale, FBS charbon de bois, charbon ou FBS plus le composant à tester. Notez que plusieurs composants peuvent être testés dans chaque expérience. Peser et diluer les hormones, les facteurs de croissance, cytokines ou de façon appropriée pour être dissous dans le sérum dépouillé de charbon de b…

Representative Results

L'indice d'invasion est calculé pour chaque condition de normalisation selon l'une lignée cellulaire non invasive. Pour les expériences, on utilise la ligne 1205Lu cellulaire de mélanome et les lignées cellulaires stables variantes établi comme nos lignes envahissantes ainsi que la variante non invasive prémalignes, WM793 partir duquel les cellules ont été dérivées 1205Lu 10 qui sert de contrôle logique. Nous utilisons également collagène I que la matrice d'invasion parce que ce …

Discussion

Tumeur métastase est un processus en plusieurs étapes. Les cellules doivent franchir la membrane basale, intravasate soit dans le système lymphatique ou le sang microvaisseaux, dans lesquels ils sont transportés à des sites distants. Les cellules tumorales puis extravasent et colonisent dans un macrométastase ^12. La progression à travers la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT), l'invasion tumorale et la métastase a été renforcée par des hormones stéroïdes ^13,14, les facteu…

Materials

Item	Vendor	Catalog #	Comments/Description
BioCoat Control Inserts with 8.0µm PET Membrane (12 in each of two 24-Well Plates)	Corning	354578	polyethylene teraphthalate (PET) membranes
Collagen I, rat tail	Corning	354236	Source = rat tail tendon, purity = 90%
Fixative; Diff-Quick	Thermo Fisher Scientific	NC9844047	Methanol-based fixative, Hmatoxylin/Eosin
Fetal bovine Serum	Life Technologies	16000	Designated as FBS
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Life Technologies	12676	Designated as CS-FBS
Fetal bovine Serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30070	Designated as FBS
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum	Thermo Scientific Hyclone	SH30068	Designated as CS-FBS